作者：何高阳|美格基因（文案|何高阳、编辑|姚晓韵）

本期为大家分享一篇circRNA研究案例，快来跟小编一起学习吧~

Identifying and characterizing the circular RNAs during the lifespan of Arabidopsis leaves

鉴定并表征拟南芥叶生长周期中的环状RNAs

作者：Tengfei Liu, Li Zhang, Geng Chen and Tieliu Shi

期刊：Frontiers in Plant Science

时间：2017

IF: 3.678

DOI: 10.3389/fpls.2017.01278

背景

叶是植物的一种重要器官，作为生态系统中的初级生产者，其利用光能固定碳并为其它物种生产食物。叶在其生长周期中有序的经历了一系列发育、生理和代谢的转变。在生长阶段，叶通过光合作用累积化学能和营养；在衰老阶段，叶细胞经历了代谢和细胞结构的显著变化，这是一个非常复杂的遗传过程，涉及多个层次的调控。

CircRNAs是真核生物中一类主要的非编码RNAs，可由外显子、内含子和转录间隔区产生。先前的一些研究揭示circRNAs可以在转录和转录后水平调节基因表达，而且还能通过隔离和阻止miRNAs结合对应的靶基因而成为miRNA海绵。然而，circRNAs的生物发生和功能还有待研究。植物中circRNAs的探索才刚刚开始，作者为了探索拟南芥叶生长周期中circRNAs的数量及其在调控叶发育和衰老中的潜在功能，先结合qPCR验证在基因组范围鉴定circRNAs及其表达模式，然后通过miRNA海绵和相关mRNAs功能预测来研究circRNAs的潜在功能。

实验设计

Arabidopsis thaliana 基因组（TAIR10）序列下载自Ensembl Plants数据库，拟南芥叶RNA-seq数据（GSE43616，序列长101 bp）用于鉴定circRNAs，包括14个时间点，从叶出现后4天到30天，每间隔2天为1个时间点；其中又分为G-到-M阶段（生长到成熟阶段，4~18天），M-到-S阶段（成熟到衰老阶段，16~30天）

主要结果

1. 拟南芥叶中circRNAs的概述

表1. 拟南芥叶中的环状RNAs

本文共鉴定了168个circRNAs，与PlantcircBase数据库中拟南芥比对发现其中40个为新的circRNAs。所有的circRNAs中，有158（94.1%）个是从相应基因的外显子产生；其中134个（84.8%）的剪接位点完美落在外显子两端，8个（5.1%）的两个剪接位点落在外显子内位点；16个（10.1%）的一个位点落在外显子末端，一个位点落在外显子内。142个（89.9%）外显子circRNAs包含1-5个宿主基因派生的外显子，且没有发现任何从内含子产生的circRNAs（表1）。

进一步分析分别在G-到-M和M-到-S阶段鉴定了66个（39.35）和144个（85.75%）circRNAs，其中在两个阶段都表达的有42个，说明更多的circRNAs只在叶衰老阶段表达。编码circRNAs宿主基因的GO富集分析显示，其主要涉及胚发育、细胞代谢过程负调控、生殖系统发育等生物学过程。

图1. 叶生长周期中circRNAs的分布及DE-circRNAs的表达模式

2. 鉴定差异表达的circRNAs

通过4倍差异阈值筛选，发现6个circRNAs在G-到-M阶段差异表达（5个上调，1个下调），35个在M-到-S阶段差异表达（34个上调，1个下调）。而且有3个circRNAs在G-到-M和M-到-S阶段表达都有差异，更多的circRNAs则在M-到-S阶段表现出差异表达，且几乎都是上调（图1）。

3. 环状RNAs的验证

对包括1个新circRNA Cir-AT1G19860在内的4个高表达circRNAs进行qPCR发现，其表达模式与RNA-seq保持一致，随着叶的发育，4个circRNAs表达上调且在衰老阶段最高（图2）。

图2. 4个高表达circRNAs表达模式的qPCR验证

4. 衰老阶段上调circRNA的表达一定程度上不依赖于宿主基因的表达

结果发现没有G-到-M阶段的上调circRNAs有相应上调的线性RNA，且在M-到-S阶段只有9/34的上调circRNAs有线性RNA表达的同时增加。结果表明，叶衰老阶段circRNAs的上调并不是相应宿主基因转录上调的结果。

5. 构建circRNA-miRNA-mRNA网络

利用不同方法预测52个差异表达miRNA的差异表达转录本和circRNAs靶标，确定了miRNAs与相应靶标表现出表达负相关（spearman相关系数≤-0.5）的circRNA-miRNA-mRNA对（G-到-M和M-到-S分别有20和220对），可以发现M-到-S阶段的调控网络更加复杂，说明circRNAs在衰老过程中的表达调控很活跃（图3）。

图3. G-到-M和M-到-S的circRNA-miRNA-mRNA网络

6. 功能注释

GO分析结果显示G-到-M阶段的生物学过程属于多种代谢过程，如生物合成过程调节和细胞代谢过程调节，而在M-到-S阶段除了多种代谢过程外，还发现了激素响应、渗透胁迫响应、有机质响应及其它生物学过程；叶发育和衰老期间差异表达circRNAs预测的靶标mRNAs的GO分析显示其与多种生物学进程有关（图4）。

图4. 不同阶段差异表达circRNAs靶标基因的生物学过程谱

KEGG通路分析共获得11个通络，其中一些在拟南芥或其它植物中与叶的发育和衰老有关。结果显示，在G-到-M阶段只有1条通路（植物激素信号转导），而在M-到-S阶段情况更复杂，总的来说属于3个主要部分，叶绿素降解、激素转导和代谢变化（图5）。

图5. 拟南芥叶M-到-S阶段可能涉及差异表达circRNAs及其靶标基因

小 结

总的来说，本文在拟南芥叶中鉴定了包括40个新的在内的168个circRNAs，且揭示了circRNAs可能倾向于在衰老过程中累积。此外，在衰老阶段circRNAs的表达在一定程度上不依赖于与宿主基因的表达。circRNA-miRNA-mRNA网络分析表明circRNAs参与衰老响应过程，比如卟啉和叶绿素代谢及植物激素信号转导。本研究揭示了circRNAs可能在拟南芥叶衰老阶段起到新转录后调节因子的作用。