circRNA社区-小技能4条评论

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每天师兄都要刷刷pubmed,因为师兄最近得了一种不看文献心痒痒(这周组会该我了),不做实验不自在(不想留在实验室过年),不听老板谆谆教诲就不痛快(标书啊标书)的怪病,发现两篇好文跟大家分享。

 

CircRNA的研究技术路线该怎么规(chui)划(niu),间隔一周发的两篇10分文章,咱们也来取取经。

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(1)国自然热点

 

2017年申请到的circRNA项目是140+项

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(2)一文了解circRNA的研究技术路线

 

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咱们就拿其中一篇文章来研究一下吧

 

期刊:Ann Rheum Dis,13分

单位:上海第九人民医院矫形外科

疾病:腰椎间盘退变(IVDD)

前期实验设计思路:先讲miRNA→再讲mRNA→最后circRNA→细胞模型+大鼠模型→IVDD

故事梗概1、2、3、4、5:

 

Step 1选择细胞模型和动物模型

 

发现临床问题后,确定细胞和动物模型,在细胞、动物模型中来建立临床问题和科学假说的直接联系。
可以取组织或者器官最丰富或者最重要的细胞系或者原代细胞,进行传代培养,例如这里面是Nucleus pulposus cell(髓核细胞),一种在腰间盘最丰富的细胞类型,而且分泌多种细胞外基质+细胞因子,调控腰间盘的微环境。
动物模型:IVD大鼠模型

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Step 2:先从哪个分子着手呢?miRNA!

 

mRNA?miRNA?CircRNA?

先从miRNA入手吧,上可找circ,下可寻mRNA。

呵呵,没钱测序?GEO里有啊,GSE45856。

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三个miRNA上调表达,为啥要选上调的?做表型会稍微容易些。

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那接下来就是一顿围绕miR-200c的操作了

Q-PCR、Northern blot:在病人的组织样本中验证一下表达量;

miRNA的拮抗剂和mimics:正常细胞株中转染miR-200C mimics→细胞凋亡检测→凋亡相关蛋白的WB以及Q-PCR实验←细胞凋亡检测←miR-200C拮抗剂;

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Step 3mRNA?CircRNA?→mRNA!

 

可以选择先讲下游的调控机制:miRNA的下游靶基因

咱们上面说到,正常细胞转染mimics后出现了凋亡。

接下来就是miRNA靶基因预测神器:Starbase

①预测的几百个基因→DAVID的GO和KEGG→凋亡信号通路相关的mRNA若干→XIAP等凋亡基因

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②miRNA调控靶基因mRNA的表达验证:

 

荧光素酶报告实验(XIAP的结合位点突变)→证明miRNA功能上结合该位点并调控mRNA丰度;

细胞模型中转染miRNA的拮抗剂和mimics→WB、Q-PCR检测靶基因XIAP的表达→Rescue实验敲减靶基因→细胞凋亡检测、凋亡蛋白markers检测

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Step 4CircRNA!

 

怎么预测miRNA的上游circRNA呢?万能的神器starbase!

还真别说就是这么好用!

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又是一顿互作的操作和表型检测

①证明该circRNA确实存在,且和其他转录本区分开:PCR、样本验证、FISH定位

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②cricRNA的敲减和过表达:miRNA、mRNA的表达量以及细胞凋亡检测

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③证明该circRNA和miRNA互作:CLIP sequence,IP-pulldown、FISH定位

CLIP测序:检测circRNA中有几个miRNA的结合位点!

AGO2的RIP实验:AGO2“筹划”了RISCs(里面含有miR-200c)对于目标mRNA的切割过程,那么对纯化产物做circRNA的Q-PCR,就可以评估circRNA和miRNA互作深度:

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Step 5大鼠体内验证circRNA的功能

 

因为病变组织中,circRNA是低表达的,这时候就需要在大鼠模型中的腰间盘里过表达circRNA了:检测是否转染成功、镜检腰间盘病例切片分期

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好了,circRNA研究路线会设计了吧!

最后不要忘记假说机制图啊!

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文章:小张聊科研|微信公众号

circRNA-moban

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