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随着去除核糖体测序技术深入发展,越来越多的环状RNA(circRNA)不断报道发现,基于生物信息学分析显示circRNA发挥着极其重要的生物学功能。然后如何采用实验手段进一步验证circRNA的生物学功能显得尤为重要,为此小编特别邀请技术部刘建宁老师,带大家一起探讨circRNA功能验证策略。

 

circRNA定量验证

 

circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同,常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物,称之为convergent primer,需扩增的片段位于上下游引物之间(如图1.1)。而对于circRNA,尤其外显子环化circRNA,除backsplice junction位点处不同于linear RNA之外,body区与linearRNA是一致的。因此,验证时需要特异性针对backsplice junction位点处设计primer,称之为divergent primer(如图1.1),而且设计的PCR product的长度越短越好,可以增强backsplice junction位点处扩增效率。

1图1. convergent primer vs divergent primer

 

为增强circRNA的验证效率,起始模版需满足以下要求(3 free):1. DNA free;2. rRNA free;3. linearRNA free。

 

验证策略:对3free RNA以及genome DNA同时进行PCR扩增,电泳检测PCR product大小(如图2)。

 

 

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图2 circRNA引物扩增结果

 

circRNA Northern blot验证

 

Northern blot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法,需围绕circRNA设计探针序列,而探针序列设计是验证成功至关重要的环节。对于circRNA探针设计,我们建议以下两点:1. 对于外显子环化circRNA,建议探针尽可能跨backsplice junction位点;2.对内含子环化circRNA,可围绕内含子区域设计探针。

 

验证策略:对3 free RNA、total RNA以及genome DNA同时进行杂交验证。

 

circRNA过表达

 

circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制,已有多篇文章报道circRNA成环机制,目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对,称之为Alu结构(如图3)。

 

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 图3 circRNA侧翼结构特征

 

基于circRNA侧翼Alu序列特征,PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列,随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切,进而连接pEGFP-C1载体。连接载体进而转染对应细胞样本,定量PCR检测转染效率。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数。

 

过表达策略:

1. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列,侧翼上下游1kb处过表达效率更佳;

2. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。

 

circRNA敲除

 

circRNA敲除思路主要针对circRNA backsplice junction处序列信息设计siRNA,对于内含子环化circRNA,也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰。Divergent primer验证circRNA敲除倍数。

 

敲除策略:

 

1、外显子环化circRNA,针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA,如图4所示;

2、内含子环化circRNA,除针对backsplice junction位点前后序列设计siRNA序列以外,也可针对内含子区域序列设计siRNA。

3、每个siRNA设计对应的对照,backsplice junction位点一端互补配对,另一端错配,如图3所示。

4图4 基于siRNA敲除策略

 

参考文献

New Phytologist (2015) doi: 10.1111/nph.13585.

Nature Structural&Molecular Biology (2015) doi:10.1038/nsmb.2959.

RNA (2013) 19:141–

Cell Reports (2015) 10, 170–

circRNA-moban

 

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