小技能25条评论

0

 

CircRNA引物设计

 

与常规PCR引物设计不同,circRNA引物设计应满足以下原则:

 

1、对于外显子环化circRNA,引物跨剪切位点(backsplice)设计;

2、对于内含子环化circRNA,可跨剪切位点设计,也可围绕内含子区域设计引物;

3、扩增产物长度建议不超过100 bp。

 

一、序列位置变换

 

由于已获取的序列为环序列从剪接位点(backsplice)处打开后的线性序列,因此,为复原序列成环时的位置关系,应先进行序列位置变换后再进行引物设计(设计原理如下图)。

 

1

 

二、截取3’端50-100 bp长度序列置于5’端头部,形成一个新的序列。以hsa_circ_0063162为例,具体步骤如下:

hg19_hub_1_salzman_circRNAsrange=chr22:36889680-36889850

5′ CTGCATAGAAGCTTCGCAAATCGGTGTCCAAACAGTTCTCCAGGAAGCGCCTCAGAGGTAGGATGTGCCCGATCGGGGCAGTCCAGTCTGTTAAGAAGTCTTCCACGATGTGATGGATGGCCGTGGGCCGAGGCAGGGGCCAGTGTGCAGGGCGGAACCTCACCTCCTGTT 3’

 

三、将3’端蓝色序列移至序列5’端头部,位置变换后的新序列如下:

5′ TTAAGAAGTCTTCCACGATGTGATGGATGGCCGTGGGCCGAGGCAGGGGCCAGTGTGCAGGGCGGAACCTCACCTCCTGTTCTGCATAGAAGCTTCGCAAATCGGTGTCCAAACAGTTCTCCAGGAAGCGCCTCAGAGGTAGGATGTGCCCGATCGGGGCAGTCCAGTCTG 3′

 

四、新的序列中蓝色字体与黑色字体碱基相连处即为circRNA剪接位点处,引物设计按照常规PCR引物设计原理,跨剪接位点上下游进行设计,最终扩增产物必须包含剪接位点。

 

五、Primer 5引物设计步骤

 

打开 primer 5.0 软件,点击“File”/New/DNA sequence,如下图所示:

 

2

 

六、复制粘贴新的circRNA序列至软件中,如下图:

 

3

 

七、点击  primer按钮进行引物设计,如下图:

 

4

 

八、点击 search按钮,程序会自动设计引物,系统弹出下图对话框。请在以下对话框中修改参数,包括正反向引物结合模版起始终止位点以及PCR产物。

 

以hsa_circ_0063162为例,剪接位点处于77-86之间,sense primer:1-50;Anti-senseprimer:100-171;PCR Product:20-100 bp。

 

5

 

九、引物筛选

 

填写以上参数后,点击OK按钮,程序会弹出引物Search结果,如下图所示,共有6对引物符合要求。

 

6

 

点击OK按钮,程序会弹出可选引物对的评分,如下图所示:

 

7

十、引物评估

 

对软件给出的引物根据系统评分从高到低进行筛选。以hsa_circ_0063162为例,选取评分最高的引物进行评估,如下图所示:

 

8

 

十一、引物调整

 

使“Sense”中的“Tm”与“Anti-Sense”中的“Tm”差值的绝对值不大于2.5,“GC%”=40%~70%;核对“Hairpin”,“Dimer”,“False Priming”,“Cross Dimer”,调整后结果如下图所示:

 

9

 

16.引物输出

点击“Edit”/“Copy”,输出“Sense primer”及“Anti-sense primer”,引物序列信息如下:

Senseprimer :5′  TGTGATGGATGGCCGTGG  3’;

Anti-senseprimer:5′  AACTGTTTGGACACCGATTTGC  3′

 

进一步地,可再对获取的引物进行特异性评估,将引物序列导入NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中,采用“Primer-Blast”工具进行引物特异性比对分析。

 

circRNA-moban

25 条评论

发表评论