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非编码RNA中,miRNA作为科研者的新手之友,可帮助大家跨过科研初级门槛。但学海无涯,科研亦无止境,要想攀登科研高峰,单靠miRNA还略欠些火候。而长链非编码RNA(lncRNA),这朵带刺的玫瑰,无疑是大家科研冲刺的另一大助力,则本策“革故鼎新”就讲一讲lncRNA的研究套路。

 

不同于数量偏少、机制简单的miRNA,基数庞大的lncRNA作为细胞功能的调控中枢,其机制研究复杂多变,实打实是分子变量中的真正主角,近年来也是备受科研者的追捧。而circRNA严格意义上应该是lncRNA的一个特殊亚类,只不过因其数量庞大而自成一派。既然lncRNA和circRNA同气连枝,那么只要搞清楚了lncRNA自然就解锁了circRNA。

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初接触lncRNA,必然会对其五花八门的命名方式感到头晕目眩。其中,以其功能、定位、调控对象命名的lncRNA大有所在。而就其类型而言,可分为以下几类:

 

反义(antisense, AS)lncRNA,即一类从编码基因反向转录的lncRNA,在哺乳动物中占了20%,可调控附近基因的转录。

内含子(intronic, IT)lncRNA,则是在基因内含子区域编码的lncRNA。

重叠(overlapping, OT)lncRNA,是跨越内含子和外显子的lncRNA。

长链基因间lncRNA(lincRNA),其编码区域位于两个基因中间,不与编码基因的内含子和外显子重叠。一般以大写LINC为前缀,数字为后缀。

反义上游(Antisense upstream, AU)lncRNA,与编码基因是头对头挨着(head to head),推断可双向启动子,一般会在lncRNA后缀AU字母。

eRNA(enhancer lncRNA),是由基因的增强子编码产生的,作用是促进基因转录。

 

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而circRNA没有线性mRNA的5’端帽子结构和3’末端有poly(A)尾,呈闭合环状结构,不易被核酸外切酶降解,可稳定存在于细胞中。

 

circRNA由mRNA特殊可变剪切产生的,在很多情况下会有一个同源表达的基因,但其表达却与同源基因表达不相关,是受到胞内特别调控的。circRNA的表达水平具有种属、组织、时间特异性,序列保守性比一般的线性lncRNA高。

 

它主要存在于细胞质中,大部分来源于外显子,少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中,是正常细胞功能以及疾病发生、发展中重要的参与者。绝大多数circRNA是非编码的,但也有少数跟lncRNA一样可以翻译出多肽片段。

 

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其实,研究lncRNA的前置动作也是筛猜分子。当所筛选的分子研究中还没有报道,那么首当其冲要做的就是验证该分子是否编码蛋白。

 

通常在Noncode(www.noncode.org)数据库中查询该分子序列后,可用NCBI的ORF finder来预测该序列是否具有超过100个碱基长度的ORF(开放阅读框)。在预测到了氨基酸序列后,以Blast分析检测其同源蛋白,如果检测不到则说明该序列不表达蛋白,是lncRNA。

 

此外,还可通过CSF(密码子替换频率)来计算一段序列编码的密码子在不同物种之间的保守性,并以此分析非编码RNA序列特性。因非编码RNA保守性差,当CSF评分小于0的时候,则该序列也被证实为lncRNA。

 

至于circRNA,除了证明它本身不编码蛋白,还需要证明它是环状的。果然,玫瑰有刺会扎手。那么如果大家没有足够科研实力和经费预算,也可挑选文献中已有报道的分子进行老分子套新表型研究,基于表型相关性的原则,再以通量解决概率问题,可降低lncRNA的研究难度。

 

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做完这些后,可套用单变量研究的5个步骤:基础表达、操作工具、细胞表型、动物表型和Rescue。

 

检测基础表达时,以实时定量RT-PCR检测RNA水平,也可用FISH(荧光原位杂交)进行lncRNA的亚细胞定位。值得注意的是,因lncRNA表达一般比mRNA低,在前面筛选过程中,优先选择表达量高的;最好用送测序或者芯片的同一批样品来做二次验证,如果换一批样品,批次之间也有分子表达的差异,验证效果就会差一些。

 

制备基因操作工具时,因RNAi主要在细胞浆发挥作用,那么可用CRISPR基因编辑技术将核定位的lncRNA基因给knockout掉。随后再进行细胞、动物水平的“一正一反”表型实验验证。

 

至于表型的Rescue实验,就功能基因而言,可基于密码子的简并性——密码子第三位的变动,使得每个氨基酸对应至少2个密码子——导入一个突变的过表达载体,让蛋白的氨基酸序列保持不变,而mRNA却序列可以发生改变,从而使过表达和siRNA干扰这两个操作相互独立。

 

但miRNA和lncRNA却是不做自身Rescue的。除了不编码蛋白外,还因为miRNA序列短,一旦突变就会发生功能变化,容易造成实验的假阳性;lncRNA与蛋白结合关键的序列可能就不到十个碱基,万一正好突变在关键位置,也会给实验带来干扰。

 

所以通常只会将CRISPR敲掉后的细胞重新过表达lncRNA分子,以此来进行lncRNA的Rescue验证。另外,考虑到miRNA的靶基因编码蛋白,则miRNA的Rescue策略可自然转化成回复它靶蛋白的表达。

 

总之,虽然lncRNA、circRNA的作用机制很多样,但主要有3种作用方式:1)miRNA分子海绵(miRNA sponge),像海绵一样吸引结合miRNA;2)调控基因转录,跟转录因子关系密切;3)编码小肽。后续的课程也会一一进行详细讲解,带领大家接近基础研究的高次元空间,掌握分子横向展开的各种逻辑规律和思路

 

作者:子非鱼

文章出处:酸谈  微信公众号

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