circRNA社区没有评论

1

 

越来越多的证据表明环状RNAs(circRNA)是在肿瘤发生中起重要作用。然而,circRNA在三阴性乳腺癌(TNBC)中的功能在很大程度上是未知的。作者使用circRNA微阵列来鉴定在TNBC细胞系中异常表达的circRNA。在TNBC细胞系和组织中通过定量实时PCR(qRTPCR)检测显着上调的circRNA的表达水平circGFRA1。采用Kaplan-Meier生存分析方法探讨circGFRA1在临床预后中的意义。然后通过细胞增殖,凋亡和小鼠异种移植试验检测了circGFRA1在TNBC中的功能。

2

此外,通过荧光素酶实验验证circGFRA1在TNBC中的miRNA海绵体功能。微阵列分析和qRT-PCR证实在TNBC中circGFRA1表达上调。 KaplanMeier生存分析显示,circGFRA1表达上调与存活率较差相关。circGFRA1的敲低抑制TNBC的增殖并促进细胞凋亡。通过荧光素酶实验检测表明到circGFRA1直接GFRA1和miR-34a结合。随后的实验表明,circGFRA1和GFRA1通过对miR-34a的海绵吸附作用调节彼此的表达。得出结论:circGFRA1可能作为竞争性内源RNA(ceRNA)吸附miR-34a调节GFRA1的表达以发挥调节TNBC生长的功能。 circGFRA1可能是诊断TNBC治疗的生物标志物和潜在靶点。

 

1、circRNA GFRA1在TNBC中高度表达

 

为了研究TNBC中的潜在参与调控的circRNA,作者在三种TNBC细胞系(MDA-MB-231,MDA-MB-468和BT549)和一种HME细胞系(MCF-10A)上进行了高通量的circRNAs微阵列测定。筛选出10个上调的circRNA,并进行qRT-PCR以验证前8个上调的circRNA的表达,其中hsa_circ_005239在TNBC细胞中上调的最显著(下图),其来源于GFRA1基因,于是将其命名为circGFRA1。

3

2、circGFRA1敲低后抑制TNBC细胞的生长

 

作者接下来使用RNA干扰敲低circGFRA1的表达来评估其在TNBC中的生物学功能。 qRT-PCR分析表明抑制是成功的(下图A),随后检测细胞增殖测定circGFRA1的下调会显著抑制TNBC细胞的生长(下图B),此外EdU检测显示在下调circGFRA1后,TNBC细胞的增殖潜力受损,在集落形成实验中,circGFRA1下调后,TNBC细胞集落形成能力显着降低(下图C)。

 

3、 circGFRA1作为miR-34a的海绵吸附体

 

通过分别检测细胞质和细胞核中的circGFRA1,结果显示circGFRA1主要分布在TNBC细胞的胞质中(下图A),它可能作为一个ceRNA来结合miRNA,导致相应的miRNA靶靶标转录物的释放。

 

通过预测,在circGFRA1序列内发现miR-34a的潜在结合位点,因此作者进行萤光素酶报告基因检测以确定miR-34a是否可以直接与circGFRA1结合。qRT-PCR分析表明转染成功(下图B),当circGFRA1萤光素酶报告质粒和miR-34a mimics共转染时,荧光素酶强度降低超过40%,而当circGFRA1萤光素酶报告质粒和miR-34a 干扰共转染时,荧光素酶活性显著增强(下图C)。

 

qRT-PCR检测进一步证实miR-34a mimics可抑制circGFRA1的表达而miR-34a干扰会增加circGFRA1表达(下图D),在circGFRA1敲低时miR-34a的表达会上调(下图E)。数据证实circGFRA1在功能上与miR-34a相互作用,并作为miR-34a的海绵吸附体。

4

4、circGFRA1作为miR-34a的ceRNA调控GFRA1的表达

 

为了研究circGFRA1是否作为ceRNA吸附miR-34a并释放GFRA1的表达,作者继续检测GFRA1在乳腺癌细胞系和组织中的表达,结果显示GFRA1在TNBC细胞系中也上调(下图A)。

 

此外,使用TargetScan来鉴定miR-34a的假定靶基因,并预测GFRA1,为了证实这一发现,作者构建了含有全长GFRA1 3′-UTR的萤光素酶报道基因载体,其含有miR-34a和突变型的靶位点,与miR-34a mimics转染到MDA-MB-231细胞中。 当与miR-34a mimics共转染时观察到荧光素酶活性的显着降低,当用突变体荧光素酶质粒共转染时,荧光素酶活性没有显着差异。

 

相反,当与miR-34a inhibit共转染时观察到荧光素酶活性的显着增加(下图B)。qRT-PCR和WB验证了GFRA1的表达被miR-34a抑制(下图C),此外,miR-34a的表达被GFRA1抑制(图5g)。这些结果表明GFRA1是miR-34a的直接靶标,circGFRA1可以作为miR-34a的海绵吸附体解除其对GFRA1表达的抑制作用。

5

RongfangHe,Peng Liu,Xiaoming Xie,et al. circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triplenegative breast cancer by regulating miR-34a.J EXP CLIN CANC RES,2017,36:145

文:赛诚生物

circRNA-moban

来第一个抢占沙发评论吧!

发表评论