环状RNA（circular RNA，circRNA）是近来研究很热门的一种特殊的长链非编码RNA。研究发现，circRNA 在人体细胞中广泛表达，在转录后水平具有调控基因表达的重要功能，并且参与多种肿瘤和其他疾病的病理发展过程，已成为疾病研究的热点之一。迄今，全球的学者已经在包括人、鼠、斑马鱼、果蝇、线虫、酵母菌、水稻在内的动植物及真菌细胞内预测出超过10万种环状RNA，但是对环状RNA的功能及机制还知之甚少。

已报道部分环状RNA包含若干miRNA结合位点，具有miRNA 海绵功能，通过生物信息学分析已发现上万种环状RNA具有miRNA 吸附功能，但仅有少数得到了验证。此外，环状RNA还可直接结合蛋白质，也可通过RNA介导间接与蛋白质关联，影响蛋白质的功能。RNA与蛋白质的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。但是环状RNA跟蛋白相互作用的报道还不多，本文将介绍一种研究RNA与蛋白相互作用的方法，方便大家开展相关实验。

RNA Pull-Down Protocol

主要步骤

Thermo Scientific Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit[1].

材料准备
■ Sterile Phosphate Buffer Saline (PBS)
■ Cell lysis buffer (20 mMTris-HCl, pH 7.5, 150 mMNaCl, 1 mMEDTA, 0.5% NP-40)
■ Buffer A (150 mMKCl, 25 mMTris pH 7.4, 5 mM EDTA, 0.5 % NP40)
■ Streptavidin agarose beads或Streptavidin magnetic beads
■ tRNA (0.1 μg/μl)
※注：DTT，RNA酶抑制剂, 蛋白酶抑制剂（0.5 mM DTT, 100 U/ml SUPERASin,9 μg/ml leupeptin, 9 μg/ml pepstatin, 10 μg/ml chymostatin, 3 μg/ml aprotinin, 1 mM PMSF)等使用之前再加入Cell lysis buffer和Buffer A。
　　

实验步骤：准备细胞裂解物

1. 将一板细胞（~107），1000g 4℃离心5min收获细胞，弃去上清。

2. 使用加入1ml 冰冷的PBS重悬沉淀，1000g离心4℃离心5min。

3. 加入500 Cell lysis buffer （+ 新鲜的蛋白酶抑制剂，RNAse抑制剂，DTT）重悬沉淀，置于冰上5min，期间颠倒混匀几次。

4. 13000g离心4℃离心10min。

5. 收集上清直接用于实验或加入10%的甘油储存于-80 ℃，弃去cell debris。

QC: 作为Western检测cell lysate中是否有目的蛋白。RT-PCR检测cell lysate中目的RNA片段。

2 制备生物素标记的RNA

可以直接合成5’端或3’端生物素标记的DNA探针， 生物素标记的DNA探针可以与特定的circRNA结合[2]。

RNA Pull-down

1. 取150 μl streptavidin agarose beads，使用buffer A 洗涤beads，去除stock solution。
2. 准备precleared cell lysate: 将细胞裂解物与60 μl streptavidin agarose beads在 4 ℃旋转孵育30 min。
3. 2500 rpm离心30s， 保留上清，加入1倍体积的buffer A（+tRNA 0.1μg/μl）。然后加入3μg生物素标记的RNA到precleared cell lysate中。在rotary shaker中4 ℃翻转孵育1 h。

纯化生物素标记RNA结合的蛋白: 加入30 μl清洗过的streptavidin agarose beads, 4 ℃旋转孵育45min。
使用buffer A清洗beads五次。

洗脱蛋白，进行下游分析。

下游分析

MS : PBS（+100μl 2mM biotin ）与beads在室温孵育30min，每隔几分钟轻轻摇晃,得到洗脱蛋白。洗脱的蛋白可以使用TCA沉淀，胰酶消化。然后进行mass spectrometry检测。

MS检测特定条带 : 将protein loading buffer加入beads, 在 4~12%梯度的Bis -Tris gel上进行分离，使用mass spectrometry compatible silver staining kit进行银染，切取对应的胶条进行mass spectrometry检测。

Western : 将protein loading buffer加入beads, 煮沸变性5min， 在 4~12%梯度的Bis -Tris gel上进行分离，然后做Western检测相应蛋白。

[1] Pierce? Magnetic RNA-ProteinPull-Down Kit Instructions

[2] Du W W, Yang W, Liu E, et al. Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2[J]. Nucleic acids research, 2016: gkw027.