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”金桂飘香,秋风送爽“,舒爽的秋风充盈着收获的芬芳,而全长环状 RNA 领域也新晋一位成员 —— 近日,北大医学部基础医学院杨恩策研究员率领自己的团队开发了Nanopore 定量全长环状RNA新的实验策略和生物信息学方法,并将成果分享到了 eLife 上。

文章简介

继 isoCirc、CIRI-long、circNick-LRS,circFL-seq 已经是今年第四篇用 Nanopore 测序方法检测全长环状 RNA 的策略。

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circFL-seq 在实验上采用了和 CIRI-long 相似的策略,即滚环反转录(rolling circular reverse transcription, RCRT)扩增 + Nanopore长度长测序,既保证了测序能够覆盖环状 RNA 全长,又解决了三代测序序列质量较低的问题;同样,在生信方法上,circFL-seq 与 CIRI-long 都通过 BSJ(backspliced junction) 来确定 circRNA,并用 CSS(cyclinc concensus sequence) 准确解析 circRNA 全长。当然,两者仍存在一些细节上的差异。例如,实验策略上(图1),

•circFL 在滚环反转录之后会加 poly(A) 尾,随后通过加引物接头对滚环序列进行扩增

CIRI-long 在滚环反转录中同时在 cDNA 两端加接头,然后再进行扩增

图 1

同时,作者将 isoCirc、CIRI-long 与 circFL-seq 进行了对比,如下表  1

表 1

可以看到,三种策略各有千秋,至于哪种效果更好,可能还需要结合具体需求从实践中见真章。新策略新特征
环状 RNA 结构和功能研究都离不开对其全长序列的解析,例如•环状 RNA 通过序列与 miRNA 互补,作为 ceRNA 调控 mRNA 分子的稳定性或丰度•环状 RNA 序列中包含 RBP 的结合 motif,参与各种生命活动

•环状 RNA 序列中可能具有 IRES 元件,可以翻译成多肽或蛋白质发挥功能

circFL-seq 除了能够比较准确地捕获 circRNA 全长以及可变异构体(如图2 准确地识别到了 CDR1as 的两个异构体)还发现了一些新的特征。

图 2

不同种类的 circRNAs
作者根据基因组特征将 circRNA 分成了 7 类(NSS,novel splicing site),如图 3 展示了这 7 类 circRNAs 的一些特征,包括包含的 isoforms 数量、序列长度、外显子数量等。

图 3

•绝大多数外显子(99.8%)环状 RNA 都被注释过(图 3 C)•全长环状测序显示 circRNA 的中值长度是 400 ~ 600nt,也就是说很多 > 500nt 的 circRNA 并不能被二代测序检测到(图 3 D)•read through 通读环状 RNA 包含更多的外显子 (图 3 E)

•单个外显子环状 RNA 的外显子明显比多外显子长(图 3 F)

更多可变剪切事件
全长环状 RNA 测序识别可变剪切事件具有天然优势,文中主要介绍了四种事件(图 4 G),包括•ES(exon skipping ) 占比 44.3%•A3SS(alternative 3' splicing site) 28.1%

•A5SS(alternative 5' splicing site) 24.1%

•IR(intron retetion) 3.5%

图 4

相比 isoCirc 与 CIRI-long, circFL-seq 识别到了更多可变剪切事件

表 2

鉴定融合环状 RNA
融合环状 RNA (f-circ, fusion circRNA)被发现在癌症中扮演着非常重要的角色,包含两个 fusion junctions(一个属于 fusion gene,另一个是 back-spliced fusion)然而,短链的 RNA-seq 难以准确捕到 f-circ。但 Nanopore 长读长这一天然优势让鉴定f-circ 变得容易了,如图 5,作者发现了两个 antisense 基因的 f-circ。

图 5

另外,目前f-circ 的验证方法只适用于已知的 fusion gene junctions,那些未知的基因融合事件往往被遗忘了,而通过 circFL-seq 或其他全长环状 RNA 测序,我们可能会对 f-circ 有新的认识。
文章小结
circFL-seq 为全长环状 RNA 鉴定以及转录异构体的定量提出了新的实验策略与生物信息学方法,相比之前的策略,作者评估该方法在可变剪切以及 f-circ 鉴定上具有更大的优势。
参考文献
Liu Z, Tao C, Li S, et al. circFL-seq reveals full-length circular RNAs with rolling circular reverse transcription and nanopore sequencing[J]. eLife, 2021, 10: e69457.

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