宋尔卫院士团队发表在molecular cancer（影响因子15.302）杂志上的文章【Autophagy-associated circRNA circCDYL augments autophagy and promotes breast cancer progression】下面来看看，这个神仙团队具体做了什么内容。
研究背景
自噬是一种普遍存在的细胞行为，是细胞能量循环系统，自噬的发生能够将受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和细胞内含物传递到溶酶体中进行降解。细胞的自噬异常能够导致各种疾病，包括肿瘤；自噬可以为应激状态下的肿瘤细胞提供能量，帮助肿瘤细胞生存。在乳腺癌中，自噬可以通过调控自噬相关基因和非编码RNA，促进肿瘤的恶化。
circRNA在乳腺癌发展过程中有巨大的调控潜能，在乳腺癌（BC）细胞增殖、迁移、侵袭等方面发挥重要作用。然而，在BC中，circRNAs与自噬的关系以及自噬相关的circRNAs在乳腺癌临床诊断和治疗中的作用仍然需要探索。
本文在BC中发现了一个自噬相关的环状circRNA-circCDYL，并且阐明circCDYL通过miR-1275-ATG7/ULK1自噬轴促进BC的进展，可以作为乳腺癌患者预后和预测的潜在分子。
文章主要研究内容
01 、在BC中鉴定自噬相关circRNA-circCDYL
利用IHC分析自噬标志蛋白LC3在BC患者肿瘤组织中的表达，将BC患者分成LC3-high和LC3-low两组。通过IF和共聚焦拍照统计自噬体(LC3-dots-less 和LC3-dots-more)，发现自噬和BC的进展呈现负相关。
同时利用circRNA高通量测序分析5对LC3-dots-less和LC-dots-more的BC组织，筛选出38个可能和自噬相关的circRNA（筛选条件：i,差异表达倍数>2；ii，每百万序列读取的连接读取数（RPM）>200），最后通过在BC组织样品和自噬细胞模型(缺氧和EBSS饥饿处理)中进行QPCR验证，确定circCDYL是BC自噬相关circRNA。
02、 确定高表达的circCDYL与BC患者不良预后以及临床治疗反应有相关性
ISH检测BC患者的癌和癌旁组织，和癌旁组织相比circCDYL和线性CDYL在肿瘤组织中分别高表达3.2倍和1.5倍。Pearson相关分析表明，circCDYL和线性CDYL的表达与LC3-dots的数目呈正相关。与LC3-dots-less组织相比，在LC-dots-more的BC组circCDYL和线状CDYL的表达增加了2.2倍和1.2倍。Kaplan-Meier分析表明，和低circCDYL表达的患者相比，高circCDYL表达患者的无病生存率（DFS）更差。但线性CDYL的表达对BC患者的DFS无影响。
采用液滴数字PCR（ddPCR）技术检测患者血清中circCDYL的丰度，发现与早期乳腺癌（EBC）和良性患者相比，转移性乳腺癌（MBC）患者血清中的circCDYL含量最高。我们进一步检测了MBC患者化疗期间血清circCDYL的实时动力学，发现circCDYL的减少与临床治疗更好的敏感性呈正相关。在MBC患者中发现，高表达的circCDYL的患者总体生存率较差。
这些临床资料表明，circCDYL可能是预测BC患者预后和治疗反应的潜在分子。
03、明确circCDYL通过自噬调控BC细胞的增殖
利用siRNA和shRNA慢病毒干扰circCDYL的表达，过表达质粒和过表达慢病毒过表达circCDYL，而不影响线性CDYL的表达。在MDA-MB-231细胞中利用bafilomycin A1（自噬抑制剂Baf A1）对自噬抑制后circCDYL过表达后circCDYL的表达水平没有相应上升。而MDA-MB-231细胞中通过WB检测LC3-II蛋白水平来确定circCDYL过表达和干扰后，自噬水平相应上升和下降。
为了更好的观察自噬体，构建稳定表达mCherry和GFP标记LC3的MDA-MB-231细胞系（LC3-mCherry-GFP MDA-MB-231细胞系）。在LC3-mCherry-GFP MDA-MB-231细胞系中过表达circCDYL能够促进LC3-dots的数量，而干扰circCDYL能够降低C3-dots的数量。这些结果表明，circCDYL能影响BC细胞的自噬水平，但自噬不影响circCDYL的表达。
最后在BC细胞中检测circCDYL的生物学功能，发现circCDYL过表达后，BC细胞增殖增加，克隆形成增加；circCDYL干扰后有相关效果。Baf A1处理BC细胞后能缓解circCDYL过表达对BC细胞的增殖和克隆形成的促进作用。
04、circCDYL能够在BC细胞中竞争性吸附miR-1275，进而影响自噬，促进细胞增殖
AGO2-RIP实验证实AGO2可以结合circCDYL，说明circCDYL可能通过AGO2和miRNAs结合形成circRNA-AGO2-miRNA复合物发挥作用。接下来，作者通过带生物素标记的circCDYL探针，对circCDYL结合的RNA进行pull-down实验，miRNA 芯片筛选和circCDYL结合的miRNA（筛选条件：i,和NC相比，差异倍数>3；ii，miRNA归一化处理后强度>100），发现miR-1275是circCDYL的唯一特异性吸附的miRNA。然后利用qPCR验证circCDYL探针富集的RNA中有miR-1275。同时利用RNAhybrid 2.0 (https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/) 网站分析circCDYL，发现circCDYL有3个miR-1275的结合位点。利用荧光素酶报告基因检测miR-1275和circCDYL有结合。
在LC3-mCherry-GFP MDA-MB-231细胞系中过表达miR-1275能够抑制LC3-dots的数量，而抑制miR-1275表达能够增加LC3-dots的数量。在 MDA-MB-231细胞中抑制miR-1275的表达能够促进LC3-II的表达，而促进miR-1275的表达的表达能够抑制LC3-II的表达。提示circCDYL可能通过miR-1275发挥作用。
进一步在MDA-MB-231细胞中共转染miR-1275 mimics和circCDYL过表达质粒可以抵消circCDYL过表达对LC3II的上调效应，相反共转染miR-1275抑制剂和从circCDYL-siRNA可以回复沉默circCDYL导致LC3-II下调的效果。此外，增殖和克隆形成实验也表明，miR-1275可以回复circCDYL的促增值和增加克隆形成的效果。
05、circCDYL通过海绵吸附miR-1275调控ATG7和ULK1的表达
为了探究circCDYL作用miR-1275后调控的下游，作者通过3个在线网站（TargetScanHuman、miRNA.org、miRNAWalk）预测miR-1275的靶基因，发现有7个自噬相关基因。然后通过过表达和干扰miR-1275后检测靶基因的表达，发现ULK1 和ATG7的mRNA和蛋白水平也随着降低和增加。作者进一步利用miR-1275探针进行pull down后QPCR验证富集的RNA中有ULK1 和ATG7。在BC细胞中共转染miR-1275和circCDYL后，也能发现miR-1275可以回复circCDYL促进ULK1 和ATG7表达的效果。在BC细胞中共转染ULK1 （或是ATG7）的干扰片段和circCDYL过表达质粒，发现能回复circCDYL过表达促进细胞增殖和自噬的效果。
06、在动物模型中证明circCDYL通过自噬作用促进乳腺癌细胞增殖
为进一步证实circCDYL能促进BC细胞在体内的增殖，我们在Balb/c裸鼠体内建立了乳腺癌原位模型。构建稳定敲除circCDYL的MDA-MB-231细胞（sh-circCDYL），和对照细胞（sh-NC）相比，接种了sh-circCDYL细胞的小鼠，肿瘤大小更小（肿瘤体积测量和活体成像检测），小鼠体重降低更少。同时在切除的肿瘤组织中检测，发现和sh-NC组相比sh-circCDYL组ATG7、ULK1的表达降低，LC3-dots减少，Ki67指数降低。这些结果说明，circCDYL在活体内也能通过自噬促进乳腺癌的进展。
文章总结
作者选择自噬作为切入点，筛选和自噬相关的circRNA-circCDYL，在体外和体内证明circCDYL能够促进自噬增强BC细胞增殖。同时利用circCDYL探针进行pull-down，miRNA芯片筛选和circCDYL相互作用的miRNA，确定了miR-1275是其竞争性miRNA。进一步探究了miR-1275作用的下游，利用了在线网站预测miR-1275作用的靶基因，并通过干预miR-1275的表达后验证靶基因的表达，miR-1275探针进行pull-down等方法，确定miR-1275的下游是ATG7和ULK1，并通过细胞回复实验证明circCDYL通过miR-1275-ATG7/ULK1自噬轴促进BC的进展。
文章亮点
1. 从自噬的角度切入，缩小circRNA的研究范围。
2. 临床数据的队列研究很清晰，临床样品数量比较多。
3. 充分利用在线网站，例如circRNA和miRNA结合位点分析网站、miRNA和mRNA相互作用网站。
4. 用到ddPCR、circRNA-pull down、miRNA-pull down、荧光素酶报告基因检测、动物活体成像、利用荧光猝灭原理构建能够区分自噬体和自溶体的LC3-mCherry-GFP细胞系等热门技术。
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