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【发表期刊】Nature Communications

【影响因子】11.878

【发表时间】2019.07.19

研究背景

非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要组织学类型，约占80-85%，主要包括肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC），由于驱动基因的发现及分子靶向治疗的发展极大改善了LUAD的治疗状况，而在LUSC中驱动基因发现较少，且经手术、放化疗等综合治疗后，其5年生存率仍低于15%，因此深入探索LUSC发生发展的分子机制，寻找治疗LUSC的潜在分子靶点变得尤为重要。近年来，circRNA作为一种新型的调控RNA分子，越来越引起广泛研究人员的关注，随着对其结构和功能研究的深入，发现circRNA在动脉粥样硬化血管疾病、神经疾病、心脏病和癌症等疾病中起重要作用，机制上发现，circRNA可作为竞争性内源RNA（ceRNA）在多种类型癌症中发挥功能，在肺癌中，LUAD相关的circRNAs被陆续发现，而其在LUSC中的功能和分子机制还远未研究清楚。

研究思路

主要结果

01

circTP63在LUSC中上调表达

通过同时分析circRNA和mRNA在5对配对的LUSC样品和健康组织中的表达，一共鉴定出7081个异常表达的circRNA，其中上调的有3157，下调的有3924个，差异表达的mRNA鉴定出2932个，其中上调的有979个，下调的有1853个（图1a step 1，图1b）。选出差异最显著的前50个circRNA，从KEGG分析中挑选最显著的细胞周期途径中的109个基因，对50个circRNA和109个mRNA做共表达分析（图1a step 2，图1c），筛选出6个可能参与细胞调控的circRNA（图1a step 3）。对这6个circRNA做RNase R酶消化处理和RT-PCR验证，筛选出hsa_circ_0068515（circTP63）（图1a step 4，图1d）。数据分析显示circTP63上调表达（图1e），qRT-PCR结果显示circTP63在LUSC组织中显著上调表达（图1f），并且LUSC组织中circTP63的表达增加与肿瘤体积的增大和患者TNM分期的升高呈显著相关。

02

circTP63在LUSC细胞中的特征

作者评估了circTP63的外显子结构，circTP63是由CTP63基因的10到11的外显子反向剪切连接衍生而来（图2a）。PCR分析表明不同的引物可以扩增来自cDNA的产物，但不能扩增来自gDNA的产物（图2b）。Northern blot结果表明circTP63可以在295nt出检测到，与预测大小一致（图2c）。用转录抑制剂Dactinomycin处理的H1703细胞中circTP63和TP63，结果表明circTP63的半衰期超过24h，稳定性比TP63好（图2d）。circTP63转录产物优先定位于细胞质中（图2e）。

03

circTP63促进细胞增殖和肿瘤生长

作者发现在SW900和H1703细胞中，circTP63 siRNAs可以成功地下调circTP63的表达，但对TP63 mRNA的表达没有影响（图3a）。circTP63在H226和H2170细胞中过表达，TP63 mRNA表达无明显变化（图3b）。表明TP63的表达不受circTP63的影响。沉默circTP63可以明显抑制细胞增长（图3c）。稳定过表达circTP63可以显著提高细胞的存活率（图3d）。细胞周期分析表明，与对照组相比，沉默circTP63可减少G2/M期细胞数量，但增加G1期细胞数量（图3e）。circTP63的异位表达导致细胞从G1/S期向G2/M期发展（图3f）。作者发现circTP63的过表达显著增加了H2170细胞的肿瘤生长，circTP63可显著提高肿瘤体积和重量（图3g）。si-circTP63明显抑制了H1703中肿瘤的生长（图3h）。

04

circTP63通过靶向FOXM1促进细胞增殖

在共表达网络中，根据Pearson相关系数值筛选25个相关的mRNA（图4a）。数据显示，25个mRNA在LUSC组织中显著上调，FOXM1在LUSC中上调超过8倍（图4b）。我们进一步确认了35对LUSC样品中FOXM1的上调水平（图4c）。与KIF18B或BRCA1相比，circTP63的表达与FOXM1呈最显著的正相关（图4d）。FOXM1在LUSC组织中显著上调，与circTP63呈正相关（图4e）。qRT-PCR和western blot结果显示，circTP63敲低显著降低了FOXM1 mRNA和蛋白的表达水平，而当circTP63过表达时则相反（图4f）。因此认为FOXM1是circTP63的一个重要靶基因。FOXM1的敲除可以抵消circTP63促进细胞增殖的作用（图4g），而FOXM1的过表达可以通过敲除circTP63，显著挽救H1703细胞的增殖抑制（图4h）。

05

circTP63可以减轻miR-873-3p对FOXM1的抑制

构建了circtp63-miRNA-foxm1网络，包括22个候选miRNA，包含circTP63和FOXM1的共同结合位点（图5a）。我们观察到多个miRNA能够降低荧光素酶活性，其中miR-873-3p下降最多，至少80%（图5b）。然后作者构建了AGO2免疫沉淀系统检测circTP63是否作为AGO2和miR-873-3p的平台，如图5c所示，转染细胞中circTP63在miR-873-3p中特异性富集。荧光素酶报告基因检测显示，与对照或突变相比，转染miR-873-3p后，circTP63或FOXM1野生型报告基因的荧光素酶活性显著降低（图5d）。作者发现，circTP63过表达或敲除可以进一步增加或降低FOXM1野生型报告基因的荧光素酶活性（图5e）。在miR-873-3p捕获的分数中，与阴性对照组比较，circTP63和FOXM1分别有近三倍和近六倍的富集，过表达circTP63 会导致FOXM1 在miR-873-3p 中的富集减少（图5f）。作者还在细胞中评估了过表达miR-873-3p后FOXM1的表达。结果表明，miR-873-3p显著降低了FOXM1表达，但circTP63过表达挽救了FOXM1的表达（图5g）。作者研究了miR-873-3p对细胞增殖的影响，miR-873-3p过表达抑制细胞增殖，而circTP63过表达可挽救miR-873-3p介导的细胞增殖和周期抑制（图5h）。

总结

该研究在LUSC病人标本中系统开展了circRNA和mRNA共表达的研究，首次发现circTP63在LUSC中高表达，且进一步对其功能和分子机制进行深入研究，发现：circTP63与LUSC病人的肿瘤大小和TNM分期呈正相关，且circRNA高表达可在体内外水平影响LUSC细胞的周期进程和增殖。机制上，发现circRNA可作为ceRNA竞争性结合miR-873-3p，进而破坏miR-873-3p对其靶基因FOXM1的内源性抑制作用，导致FOXM1的上调，从而促进其下游分子CENPA和CENPB的表达，最终驱动细胞周期和增殖的进行。总之，该研究首次发现circTP63通过ceRNA的机制驱动LUSC的发生发展，为LUSC的治疗提供了新策略。

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参考文献：

Cheng Z A, Yu C T, Cui S H, et al. circTP63 functions as a ceRNA to promote lung squamous cell carcinoma progression by upregulating FOXM1[J]. Nat Commun, 2019, 10: 3200.http://sci-hub.tw/10.1038/s41467-019-11162.