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李纪伟 上海生命基因

 

环状RNA CircFndc3b通过FUS/VEGF-A轴调节心肌梗死后的心脏修复

 

发表单位:坦普尔大学Lewis Katz医学院

 

师弟:最近的circRNA研究好热门!我看到好几篇circRNA相关的文章都发表在高分杂志上,也好想试试circRNA机制分析。师兄,听说你很精通circRNA分析,你能介绍一下circRNA文章的高分秘籍吗?
师兄:好啊。我这里刚好有一篇10+分的circRNA机制的文章,我们一起看一看作者是如何做的吧。

 

摘 要

 

环状RNA是由许多蛋白质编码基因产生的,但是它们在心血管健康和疾病状态中的作用仍然未知。在这里,我们报告鉴定在心肌梗死后(MI)小鼠心脏中差异表达的circRNA转录物,其中包括circFndc3b,其在MI后心脏中明显下调。在缺血性心肌病患者的心脏组织中,人circFndc3b直向同源物也显着下调。circFndc3b在心脏内皮细胞中的过表达增加了血管内皮生长因子-A的表达,并增强了它们的血管生成活性,并减少了心肌细胞和内皮细胞的凋亡。MI后circFndc3b过度表达减少心肌细胞凋亡,增强新血管形成并改善左心室功能。从机理上讲,circFndc3b与融合在肉瘤中的RNA结合蛋白相互作用,调节VEGF的表达和信号传导。这些发现突出了circRNA在心脏修复中的生理作用,并表明circFndc3b表达的调节可能代表了MI后促进心脏功能和重塑的潜在策略。

 

师兄:阅读文献时理清文章的分析流程十分重要,我简单整理了一下文章的逻辑脉络,就能更清晰地理解文章的内容。

师弟:谢谢师兄!

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结 果

 

1 、小鼠心脏模型的CircRNA分析

 

师兄:作者对小鼠心脏进行circRNA芯片分析,鉴定MI后的差异表达circRNA,其中circFndc3b的表达量显著下调,而qPCR验证其mRNA不差异表达。并且人的同源物也在患者中具有相似的差异变化,表明circFndc3b与MI相关。
下图是对照和心肌梗死心脏的CircRNA谱。处理组和对照组在不同时间与原始样品的circRNA的表达量差异变化表现为从蓝色增加到红色。热图是差异分析中十分常见,运用不同的颜色将基因表达量的差异直观地展示出来。

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师弟:文章中使用了circRNA芯片定量circRNA,其他文献有时候还用到RNA-seq测序进行定量分析,那么师兄,基因芯片和RNA-seq之间有什么区别呢?我们应该如何选择呢?

 

师兄:基因芯片和RNA-seq都可以用于circRNA的定量,只不过基因芯片只包含已经鉴定的circRNA,而RNA-seq有时能鉴定出新的circRNA。现在circRNA的研究才刚刚起步,有大量circRNA还未鉴定,同时如果是不常用的物种就缺少相关的circRNA信息,很难通过基因芯片定量,所以我还是建议通过RNA-seq的方法定量circRNA。这里使用的是小鼠模型进行研究,所以可以使用基因芯片进行定量。

 

师弟:那这里的同源物分析是什么?作者为什么要进行同源物分析呢?

 

师兄:同源物就是共同祖先在不同物种遗传的基因,他们的序列之间拥有一定的相似性,并且功能上的作用可能也相关。这里作者进行同源物分析其实也是一种对差异表达的circRNA的筛选,在人的同源物也与心脏疾病相关说明其更有可能发挥重要作用。

 

下图是人和小鼠circFndc3b序列的成对比对结果,相似率达到86.5%。

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2、 circFndc3b的过表达增强内皮细胞功能并减少心肌细胞凋亡

 

师兄:确定了circFndc3b作为研究对象,首先就需要对circFndc3b的环状结构进行验证。作者通过Sanger测序、RNase R处理验证了circFndc3b在Fndc3b基因的外显子2和3的反向连接。

 

师弟:嗯。鉴定circRNA的靶基因是研究circRNA的功能机制的关键一步,这篇文章是如何找到circFndc3b靶基因的呢?

 

师兄:本文是通过circFndc3b过表达后使用基因芯片分析差异基因,并通过qPCR筛选出circFndc3b可能的靶基因VEGF-A,根据VEGF-A已知的功能,体外实验验证circFndc3b的功能。基因芯片中包含了与血管生成相关的基因。也就是说,通过敲低和过表达的基因表达量变化与相关的功能结合筛选circRNA的靶基因。

 

下图是显示血管生成基因芯片的对照和circFndc3b过表达的差异表达基因的热图。

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3、 CircFndc3b过表达减轻LV功能障碍并增强新生血管形成减少纤维化
师兄:接下来,作者通过circFndc3b的过表达实验验证了其在心脏和血管相关的作用。体外实验发现circFndc3b改善了LV功能障碍,并促进血管生成,减少梗死面积。
4、 circFndc3b发挥功能的途径不是与miRNA结合,而是通过circFndc3b-FUS-VEGF-A信号网络

 

师兄:这里为了研究circFndc3b是如何靶向靶基因VEGF-A,如何发挥功能的,作者首先验证了其作为miRNA海绵的作用。预测了circFndc3b与miRNA的结合位点,并通过荧光实验验证了circFndc3b与3个miRNA有互作。将circFndc3b与靶标miRNA结合位点突变,发现circFndc3b的功能没有显著变化,说明circFndc3b的主要功能可能不是与miRNA结合发挥的。

 

师弟:这里没有验证出circFndc3b有miRNA海绵的功能,为什么还需要将这些结果发表出来呢?

 

师兄:miRNA海绵是常见的circRNA功能,从这里我们可以总结出一般circRNA的miRNA海绵功能的研究与验证过程。首先使用预测软件预测与circRNA相互作用的miRNA,然后利用荧光实验验证circRNA与miRNA的相互作用,最后通过circRNA突变或者miRNA的敲低过表达实验验证miRNA参与circRNA的功能。

 

师弟:我明白了!那circFndc3b发挥功能不是通过与miRNA结合,那会是通过什么机制呢?

 

师兄:除了充当miRNA海绵外,circRNA还会通过与RNA结合蛋白相互作用而发挥功能。作者进一步预测circFndc3b与RNA结合蛋白的互作,通过实验验证了circFndc3b与FUS的结合,并且FUS的功能与circFndc3b的功能相关。通过circFndc3b和FUS的敲低过表达实验发现靶基因VEGF的表达变化,于是构建了circFndc3b与FUS的互作调控VEGF表达的互作网络,并通过敲低和过表达实验验证了该通路在体内也调控VEGF的表达,进而调节梗死后的心脏修复。

 

师弟:那么研究circRNA与RNA结合蛋白互作有没有什么套路呢?

 

师兄:RNA结合蛋白虽然种类不多,但在转录调控相关的过程中发挥重要作用。一些RNA结合蛋白(RBP)可以与circRNA结合,造成circRNA及其同源mRNA之间的竞争,从而影响翻译。一般我们可以利用pull-down实验和RNA免疫共沉淀(RIP)验证RNA分子与蛋白的互作。

 

讨 论

 

师弟:谢谢师兄为我介绍了这么多!你对现在circRNA分析怎么看?

师兄:circRNA在疾病的基因调控过程中发挥着重要作用,现在还有许多circRNA没有鉴定,很多circRNA的功能也不了解,所以现阶段是circRNA发高分文章较容易的时期。以本篇文章为例,作者揭示了circFndc3b的外源传递在减轻MI后小鼠左心室功能障碍中起重要作用,并验证了其通过FUS / VEGF信号传导机制表现出心脏保护作用。下图为circFndc3b介导的心脏修复机制。

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材料方法

 

环形RNA芯片

 

对分别从MI和对照小鼠心脏(n=2)提取的总RNA进行CircRNA表达分析。原始表达强度被log2转化并通过分位数归一化。差异表达阈值为p≤0.05和| FC |≥2.0。

 

资料可用性

 

基因表达综合(GEO)提供了支持这项研究结果的芯片数据,登录号为GSE133503。

 

师兄:这篇文章主要内容都是围绕研究circFndc3b的功能机制展开的,所需要的实验主要包括处理组和对照的基因芯片、敲低和过表达等功能实验以及生物大分子互作筛选等机制验证,是值得学习的circRNA机制文章。你所问的高分秘籍就在于circRNA机制的一般研究方法,比如验证与circRNA互作的分子、筛选受circRNA调控的下游基因和通路、构建ceRNA网络等等,环环相扣,逻辑严密,发一篇高分文章并不是什么困难的事!

 

师弟:师兄,听了你的讲解,我终于把这篇文章理解了。你怎么会知道的这么多啊?

 

师兄:师弟,这就需要平时多看文献多做总结了。我向你推荐一个超好用的公众号:上海生因生物。这个公众号定期发布关于circRNA和RNA-seq相关的文献解读和干货视频,还提供免费的分析服务。

 

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