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就像老是后悔20年甚至10年前没有买房一样,很多人在lncRNA火了之后立马着眼于circRNA了,害怕错失良机。
今天来看一篇8分的circRNA研究吧。

 

来自于台湾国立成功大学医学院特聘教授蔡少正课题组,主要从事以下研究:

 

一、缺氧诱导因子(HIF-1α)调控基因与癌症抗药性之研究细胞因为缺氧会产生种种不同的生理反应或病理变化,包括学习记忆、癌症、心血管疾病、生长迟缓、脑部疾病、肺部疾病等。我们利用生物信息学的方法,将基因体中会受缺氧诱导因子调控之基因(包括人类、大鼠、小鼠)找寻出来,并研究其在生理、病理上的功能,尤其着重在癌症抗药性方面的探讨,目前以大肠癌及胰脏癌的抗药性机制为重点;

 

二、研究整个基因体的调控及细胞分化、去分化及再分化的机制表观基因体调控对细胞之命运影响至巨,甚或造成细胞病变。利用生物信息学、功能性基因体学、系统生物学等尖端方法,对此一现象作深入的研究;

 

三、探讨子宫内膜异位成因之分子机制本实验室过去十几年的研究,在这个领域已有相当杰出的成果,居于世界领先地位,未来将着重在整合性基因功能上的研究,期盼能发展出可以治疗该疾病的方法或药物。

 

Non-coding effects of circular RNA CCDC66 promote colon cancer growth and metastasis. Cancer Res. 2017 Mar 1.

 

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本文的第一作者是该课题组博士后萧贵阳。CircRNA CCDC66是一条非常新的circRNA,由CCDC66基因编码。课题组发现在息肉及结直肠癌中circCCDC66的表达是调控的,并且与预后状况呈负相关。体外实验表明,circCCDC66调控多个病理过程,包括细胞增殖、迁移、侵袭、锚定非依赖性生长。深入研究表明,circCCDC66通过调控多个肿瘤基因来实现上述功能。体内实验表明,敲减circCCDC66后能抑制肿瘤的增殖、侵袭作用。这表明,circCCDC66在肿瘤进程及转移过程起着重要的作用。

 

主要内容:

 

1、筛分子

 

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课题组建了一套方法,以增加map率。

 

接着作者筛选了一些亲本基因参与调控细胞周期、信号传导、表观调控、转录调控的circRNAs作为后续研究。而其中CCDC66基因的转录生物学功能鲜有报道,所以课题组决定选择circCCDC66做进一步的研究。

 

2、验证

 

通过结直肠癌细胞株、乳腺癌细胞株、胰腺癌细胞株、宫颈癌细胞株实验发现,circCCDC66在肿瘤细胞中的表达上调了,这表明在肿瘤发生时circCCDC66表达普遍提升。另外,研究发现线性CCDC66在肿瘤中的表达要低于其对应的癌旁组织。

 

且证实了缺氧条件能降低线性CCDC66转录本的水平,而circCCDC66表达无显著变化。这说明瘤内的缺氧应激能促进circCCDC66积累循环,并且由于自身的稳定性能加强这种积累作用。

 

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3、临床相关

 

首先,发现circCCDC66在癌前息肉组织中表达提升了,且在肿瘤组织中的水平更高。且在不同分期内,其在肿瘤中的水平都是高于癌旁组织。结合生存曲线,发现circCCDC66与不良预后相关。

 

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且通过ROC曲线计算出AUC为0.88,这表明circCCDC66是CRC病人病情检测和预后的一个非常好的marker。

 

4、功能验证

 

研究组设计了特定的反向剪接点的siRNA,特异性敲减circCCDC66(对线性的CCDC66 mRNA无影响)后,肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显降低。

 

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过表达circCCDC66能增加细胞的克隆形成,BrdU核素掺入法表明circCCDC66能刺激DNA合成。

 

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circRNA和mRNA及lncRNA类似,均有吸附miRNA的功能。作者通过预测,发现有99个miRNAs与circCCDC66有结合位点,这暗示着在结直肠癌中circCCDC66可能保护着一些癌基因免受miRNAs的干扰。同时结合GEO数据库中3组数据显示,这99个miRNAs中有66个在结直肠癌中表达。

 

作者通过分析结直肠癌中有显著差异表达的癌基因及肿瘤抑制基因,结果发现有37.5%的肿瘤基因与circCCDC66相关miRNAs存在结合位点,而仅有23.5%的肿瘤抑制基因与circCCDC66相关miRNAs存在结合位点。

 

进一步实验表明,DNMT3B、EZH2、MYC、YAP1这些与预测miRNAs存在结合位点的蛋白,在circCCDC66过表达时其丰度显著上调了。而其中EFNA4、FGF9这两个与预测miRNAs无结合位点的分子,则不受circCCDC66表达变化的影响。

 

接着验证circCCDC66的miRNA sponge作用。将带有生物素的线性RNA环化,用环化后的RNA去pulldown miRNAs。结果显示,miR-33b、miR-93、miR-185三条被预测与circCCDC66存在结合作用的miRNAs被带有生物素的circCCDC66富集下来。另外,实验表明在过表达circCCDC66时,MYC(circCCDC66上调蛋白)其3′-UTR区活性增强(miRNAs吸附减少)。敲减circCCDC66后发现MYC mRNA表达显著减低。Rescue实验(加入miR-33b、miR-93抑制剂)后则能回复MYC mRNA水平。这些结果均表明circCCDC66能作为miRNA的海绵,调控MYC表达。

 

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5、体内实验

 

体内实验表明,circCCDC66敲减后肿瘤在体内的生长水平受到了抑制。

 

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来源: 小张聊科研

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