转自：爱基百客生物（微信公众号）

 小伙伴都知道小编家的明星产品ChIP-seq，通过免疫共沉淀获得蛋白互作的DNA；同样的蛋白和RNA有着千丝万缕的互作关系，获得蛋白结合的RNA就需要我们的RIP-seq & CLIP-seq展现魅力了。

简单来说是通过抗体与靶蛋白进行免疫沉淀反应，将共沉淀下来的RNA分子进行高通量测序。高通量测序作为“科研神队友”，结合传统的免疫沉淀技术，摇身一变就成了现在炙手可热的热门技术–RIP-seq & CLIP-seq，接下来看看他们是怎样合体变身。

RNA Immunoprecipitation Sequencing (RIP-seq)

RNA immunoprecipitation sequencing (RIP-seq)是RNA免疫共沉淀结合高通量测序的一种技术，通过免疫沉淀靶蛋白来捕获互作的RNA。将捕获的RNA进行高通量测序，有助于了解转录后调控网络的动态过程。

1. RNA-seq不仅局限于miRNA与RNA结合蛋白（RBP）的传统研究，而且能分析RBP与lncRNA的互作网络，帮助我们了解lncRNA在的功能；

2. 与CLIP-seq相比，RIP-seq不需要进行紫外交联，操作简单，成功率更高；

3. 覆盖广，可在全基因组范围对蛋白结合位点进行筛选与鉴定；

4. 分辨率高，结合高通量测序技术，可发现新的蛋白结合位点。

1. 验证RNA与靶蛋白的相互作用；

2. 在全基因组范围内鉴定RNA与RBP的相互作用网络；

3. 分析RBP与miRNA、lncRNA等非编码RNA的相互作用。

组织破碎裂解，提取蛋白和RNA混合物；磁珠、抗体、蛋白和RNA混合物过夜孵育；多次洗涤，除去非特异结合的RNA；解交联，纯化RNA片段；q-PCR或测序分析。

The transcription factor CBFB suppresses breast cancer through orchestrating translation and transcription (Nature Communications .2019).

CBFB基因编码的蛋白质是属于pebp2/cbf转录因子家族，该转录因子家族主要调控造血（runx1）和成骨（runx2）特异性基因的宿主。CBFB也可与RNA结合发挥调控作用，通过RNA免疫沉淀后的深度测序(RIP-seq)技术， 探究得到CBFB与数百个转录本结合，其中CBFB通过hnRNPK与mrna结合，并通过eIF4B(一种常见的翻译起始因子)增强翻译。核CBFB/RUNX1复合物在乳腺癌中转录抑制致癌NOTCH信号通路。此研究为癌症的靶向治疗提供新的方向。

Fig. 1 Genome-wide binding of CBFB and hnRNPK to mRNAs. RIP-seq of FLAG-CBFB

 UV Cross-linking and Immunoprecipitation (CLIP-seq)

紫外交联免疫沉淀(UV cross-linking and immunoprecipitation, CLIP)用于研究RNA结合蛋白在体内与众多RNA靶标的结合模式，揭示其生物学功能。主要原理是基于RNA分子与RNA结合蛋白在紫外照射下发生共价结合，提高RNA结合蛋白与相应RNA靶标的结合强度。

1. 准确性高：从活细胞交联开始，反应了体内环境下真实的分子间互作。

2. 特异性强：紫外辐射不会造成蛋白和蛋白之间的交联，能够鉴定靶蛋白和RNA 之间的直接相互作用。

3. 应用范围广：特别适用于研究剪接因子RNA结合图谱、miRNA作用靶点等研究。

1. 验证RNA与靶蛋白的直接相互作用及精确的结合位点；

2. 在全基因组范围内鉴定RNA与RBP的相互作用网络

3. lncRNA/circRNA功能机制研究以及miRNA靶标鉴定

紫外交联，组织破碎裂解，利用RNA结合蛋白的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀，回收其中的RNA，并进行高通量测序，再经生物信息学的分析，进而深入揭示RNA结合蛋白与RNA分子的调控作用及其对生命的意义。

案例分享

Hfq Globally Binds and Destabilizes sRNAs and mRNAs in Yersinia pestis (Molecular Biology and Physiology. 2014).

Hfq是细菌中普遍存在的一种Sm-like RNA-binding protein，参与了细菌的生理适应度和发病机制，但其在体内结合机制尚不明确。采用 (CLIP-seq)方法探究得到Y. pestis中全基因组的hfq结合RNA。发现Y. pestis的Hfq结合80%以上为mRNA，而且Hfq结合非编码小RNA (sRNAs)，Motif为AGAAUAA和GGGGAUUA。这些结果共同展示了高质量的Hfq-RNA在Y. pestis中的相互作用图谱，这对于进一步破译Hfq-sRNAs在Y. pestis中的调控作用具有重要意义。

Fig. 2 CLIP-seq revealed that Hfq binds more than 80% of transcribed RNAs in Y. pestis.

近年来，研究人员不仅仅关注于DNA或RNA序列本身，对于非序列依赖性的表观遗传修饰，也会产生更大的兴趣；曾经被认为是垃圾DNA的非编码片序列也引起了研究人员极大的兴趣；同时，RNA结合蛋白的功能以及转录后的RNA调控网络也备受关注，为了解决这些问题，满足大家的科研需求，推出了RIP-seq和进阶版的CLIP-seq技术。