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作者：汪桂华 浦江 沈蕾 鞠少卿

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，其发病率和死亡率近年呈急剧上升的趋势，已成为严重危害妇女身心健康甚至危及生命的常见肿瘤^[1]。因此，对乳腺癌患者的早期筛查及预后判断至关重要。随着对肿瘤表观遗传研究的不断深入，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）的表达异常被认为是肿瘤发生的早期事件，其在乳腺癌发生发展中的作用逐渐被认识。ncRNA以微泡、外泌体或蛋白质复合物形式进入血液循环系统，形成循环ncRNA。

液体活检是一项新兴的检测患者体液中含原发肿瘤生物特性分子的技术，包括对循环肿瘤核酸、循环肿瘤细胞和外泌体等的检测。循环肿瘤核酸中的ncRNA作为一类液体活检的主要检测对象已被广泛应用于辅助诊断、预后判断、疗效评价等。循环ncRNA作为一种创伤小、特异性和敏感性较高的液体活检标志物，其在乳腺癌诊断及预后的研究也越来越广泛深入^[1,2]。

ncRNA为RNA家族中一类不编码蛋白质的RNA，主要分为小非编码RNA、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和环状RNA（circularRNA，circRNA）。小非编码RNA主要包括了微小RNA（microRNA，miRNA）、Piwi互作RNA（Piwi-interactingRNA，piRNA）、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）等^[3]。ncRNA在表观遗传、转录以及转录后水平等多个层面调控基因的表达，参与调节恶性肿瘤的发生及进展，在恶性肿瘤发展的不同阶段表达改变，正成为肿瘤分子生物学研究领域的新热点。

ncRNA具有以下特点：（1）循环ncRNA的表达与肿瘤发生密切相关，其表达异常可以导致肿瘤的发生，随肿瘤进展其表达改变，因而使得ncRNA具备作为肿瘤诊断标志物及预后标志物的潜力。此外，某些ncRNA的表达具有组织特异性，或仅由特定肿瘤细胞分泌，并且肿瘤细胞能通过微泡或外泌体选择性将胞内某些ncRNA释放到胞外^[4]。因此ncRNA可作为鉴别肿瘤来源的特异性肿瘤标志物。（2）循环ncRNA表达稳定，miRNA在血浆、血清、尿液、脑脊液及唾液中均稳定表达^[5]，lncRNA稳定性虽然不及miRNA，但其与有蛋白质编码功能的mRNA相比，在血清中仍有相对长的半衰期^[6]。（3）随着分子生物学技术的发展，循环ncRNA表达水平可以通过成熟高灵敏技术检测，这使得循环ncRNA作为疾病诊断标志物具备了临床检测的可行性与便利性^[1]。

检测循环ncRNA的常用方法有微阵列芯片、RNA测序、Northern印迹杂交和实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）等。微阵列芯片和RNA测序是近年来广泛应用的高通量检测方法，能够在短时间内快速分析大量的生物分子，效率比传统检测手段高上千倍，是一种简便的高通量检测方法，常用于寻找和筛选诊断及预后标志物、药物治疗靶标。qRT-PCR是用来检测循环ncRNA的一种常规方法，因其较为简便的步骤和较低的成本而得到了广泛的应用。然而，由于患者人群差异（病理分期分型、年龄、种族、治疗方案均可影响ncRNA的表达）、实验设计方案的不同、样本（全血、血清与血浆）及RNA提取方法差异、不同内参的选择、统计方法的复杂性等诸多问题，使得ncRNA在临床上的应用还没有得到广泛的认同。

1．乳腺癌相关的循环miRNA：

miRNA是一种内源性单链小分子RNA，长度约22个核苷酸，主要参与基因转录后调节，在多细胞生物的发育中起重要的调节作用，其异常表达与乳腺癌的发生、发展、侵袭和转移密切相关。

miRNA可以稳定存在于组织和血液中，血清与血浆的表达谱一致性极好，可以耐受极限条件而不被降解。Lawrie等[7]对血清miRNA表达水平进行了研究，他们发现miRNA（miR）-21的血清水平与弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的无复发生存率相关。Zhu等^[8]通过qRT-PCR法对13例乳腺癌患者和8名正常对照的血清标本进行检测，证实乳腺癌患者血清中存在可检测的循环miRNA，并且miR-155在孕激素受体（progesterone receptor，PR）阳性肿瘤中表达水平增高。随后的大量研究相继报道了循环miRNA可作为乳腺癌的早期诊断的候选标志物，例如miR-21、miR-221、miR-145和miR-133a等^[1]。Gao等[9]qRT-PCR法检测了北京地区89例乳腺癌患者血清miR-21的表达，发现miR-21诊断乳腺癌的敏感性高于传统的肿瘤标志物糖类抗原（carbohydrateantigen，CA）153和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），是诊断早期乳腺癌的潜在肿瘤标志物。另一项研究对患有乳腺癌、纤维腺瘤和健康对照受试者的共100例埃及女性的血清miRNA基因芯片筛选、qRT-PCR确证分析，发现miRNAs-21/221作为埃及妇女乳腺癌诊断的潜在生物标志物，而miR-221在区分乳腺癌和纤维腺瘤患者方面具有更强的诊断能力^[10]。几种miRNA联合使用作为乳腺癌分子标记物可提高检测的灵敏度。Chan等^[11]通过锁核酸（locked nucleic acid，LNA）探针qRT-PCR实验在新加坡132例乳腺癌患者血清中证实miR-1、miR-92a、miR-133a和miR-133b可选择性释放于血清中，其组合诊断乳腺癌的ROC曲线下的面积为0.90~0.91，作为一种乳腺癌液体活检方法，临床应用前景广阔。一项通过qRT-PCR法对日本国立癌症研究中心医院1 280例乳腺癌血清大样本的研究验证乳腺癌患者血清5种miRNA（miR-1246、miR-1307-3p、miR-4634、miR-6861-5p和miR-6875-5p）的组合可以检测早期乳腺癌，敏感度为98.0%^[12]。

另有大量研究发现，循环miRNA的表达还与乳腺癌的病理特征及预后评估相关。包括miR-149和miR-30a-3p在内的5种血清miRNA与乳腺癌的早期复发有关，通过对这类血清miRNA的测定预测原发性乳腺癌手术后可能发生早期转移的患者^[13]。乳腺癌分型中的三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）与早期肿瘤复发和预后不良相关，血清4种miRNA（miR-18b、miR-103、miR-107和miR-652）可作为TNBC患者肿瘤复发和总生存期的预测组合，这种预测模型可能最终为TNBC患者带来更好的治疗选择。miR-155、miR-19a、miR-181b、miR-24和一种肿瘤抑制miRNA（let-7a）组合可用于评估早期乳腺癌的复发风险，且独立于现有的其他任何指标^[14]。此外，循环miR-451在新辅助化疗耐药的乳腺癌患者中表达降低；循环miR-19a和miR-205的组合可预测luminal A亚型乳腺癌对表柔比星和紫杉醇新辅助化疗的化学敏感性^[15,16]，而miR-155对化疗药长春瑞滨更为敏感，是一个评估治疗效果的潜在的分子标志物^[17]。以上研究表明，乳腺癌患者血清miRNA的检测不仅可用于早期筛查、预后分析，也可用于化疗药物疗效及耐药的评估。

2．乳腺癌相关的循环lncRNA：

lncRNA是一类长度大于200 nt，无明显开放阅读框，不具备蛋白质编码功能的RNA分子。lncRNA的功能涉及许多生物进程的调控，例如基因组印迹、染色质重塑、组蛋白修饰、转录激活以及核内运输等，在表观遗传、转录以及转录后水平等多个层面调控基因的表达^[18]。lncRNA参与了许多疾病的病理生理过程，尤其是在多种肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色，正成为肿瘤分子生物学研究领域的新热点，现已发现许多在乳腺癌发生发展中起重要作用的lncRNA分子^{[19,20,21,22]}。相对于肿瘤组织而言，外周血循环lncRNA作为诊断标志物更有优势。

初步探索已证实循环lncRNA可成为潜在的肿瘤分子标志物。Xu等^[23]在乳腺癌患者和健康人血清样本中检测了lncRNARP11-445H22.4的表达，发现该lncRNA在乳腺癌患者血清中高表达，其表达水平与乳腺癌患者的雌激素受体（estrogen receptor，ER），PR和绝经状态相关。RP11-445H22.4诊断乳腺癌的敏感度和特异度分别为92%和74%，比常见肿瘤血清标志物CEA、CA125和CA153的敏感度和特异度更高；与传统影像学的诊断方法比较，该lncRNA也有更高的敏感度。Miao等^[24]发现乳腺癌患者的血清样本lncRNA肺腺癌转移相关转录因子1（metastasis associated lung adenocarcinomatranscript 1，MALAT1）的表达显著高于良性乳腺疾病，ROC曲线下面积为0.833，提示lncRNAMALAT1可作为诊断标志物用于乳腺癌患者的筛查。Zhang等^[25]研究发现血浆H19的表达在乳腺癌患者中显著增高，ROC曲线下面积为0.81（敏感度为56.7%，特异度为86.7%），高于CEA和CA153；术后血浆标本H19水平显著低于术前标本，提示血浆H19可作为乳腺癌早期筛查和预后监测的潜在生物标志物。Yu等^[26]通过meta分析综合10项研究发现，血清标本中H19、HOTAIR、MALAT1、ANRIL等7种lncRNA组合诊断乳腺癌的敏感度为83%，高于血浆标本，而基于血浆标本检测的特异度更高。循环lncRNA检测在乳腺癌中的初步应用，显示了较大的潜力，但还需要进一步了解影响循环lncRNA检测结果的技术和生物决定因素，以解决其作为生物标志物的可重复性问题^[27]。

3．乳腺癌相关的循环circRNA：

circRNA是一类呈闭合环状结构，不具有5′末端帽子和3′末端尾巴的特殊内源性非编码RNA，主要由外显子转录产物组成。circRNA可从转录和转录后水平影响基因表达，异常表达的circRNAs参与了包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展过程^[28]。circRNA与线性RNA分子不同，具有闭合的共价环状结构，不被核酸外切酶降解，性质较为稳定。circRNA的表达具有物种、组织特异性和保守性等特点，在外泌体中含量丰富且稳定，具有作为新一代肿瘤监测的理想分子标志物的潜力^[29]。

目前，已有研究证实某些circRNA可作为miRNA的分子海绵，调控乳腺癌的增殖、侵袭和转移等^[30,31]。Yin等^[32]揭示了乳腺癌外周血中异常的circRNA表达谱，并确定了血浆hsa_circ_0001785在乳腺癌中的潜在诊断价值。hsa_circ_0001785比CEA（AUC=0.562）和CA15-3（AUC=0.629）具有更好的诊断准确性（AUC=0.784），且hsa_circ_0001785血浆水平与组织学分级、肿瘤-淋巴结-转移（tumor node metastasis，TNM）分期和远处转移密切相关，术后患者血浆hsa_circ_0001785水平明显低于术前患者。

循环ncRNA作为生物标志物用于乳腺癌筛查仍处于早期阶段，并且在临床使用这些生物标志物之前需要解决各种临床和临床前问题。

首先，技术因素限制了循环ncRNA作为乳腺癌生物标志物的检测方法的建立。在研究乳腺癌患者差异表达的循环miRNA的研究中，很少有相同表达谱的病例。存在这些差异的主要原因是缺乏用于检测体液中肿瘤特异性ncRNA的标准化和通用的方法，需要建立一种具有通用参数的体液中肿瘤特异性ncRNA检测的方法^[1,27]。其次，需要更大的前瞻性临床试验来验证这些结果，大多数已发表的研究样本量较小且缺乏长期数据。第三，血液中常见的上调miRNA由几种癌症类型共享，特别是那些具有共同起源的癌症，因此需要进一步的研究来确立对乳腺癌特异的ncRNA^[2]。使用现有的生物标志物如肿瘤抗原等与ncRNA组合也可以提高乳腺癌检测特异度和敏感度^[12]。第四，需要更多的研究来确定哪些循环ncRNA能够预测肿瘤的分期，对治疗的反应及患者预后。

ncRNA作为时下研究的热点，为肿瘤的研究带来了新的机遇。ncRNA中circRNA作为血清标志物的特异性较高，但其研究仍处于起步阶段。大量lncRNA和circRNA功能未知，部分是通过调控miRNA间接调控靶基因实现其功能，lncRNA、circRNA与miRNA之间既存在竞争结合又存在协同关系，他们之间复杂的调控共同参与肿瘤的发生和发展，对其机制的深入研究也将面临着挑战^[33]。miRNA是介导细胞生物学效应的重要的外泌体内容物，最近对外泌体和其他胞外囊泡的研究再次引发了对循环miRNA临床应用的兴趣，血清或血浆外泌体miRNA的分析用于早期乳腺癌诊断或监测治疗反应和疾病进展具有较好的应用前景^[34]。

液体活检技术是未来临床肿瘤诊治的发展方向，血清或血浆中有效的肿瘤标志物能够辅助医生早期诊断、早期治疗，指导临床方案的制定，实现真正的个体化精准医疗。循环ncRNA在乳腺癌的临床诊断、预后判断、疗效及耐药预测方面具有重要的研究价值。循环ncRNA作为一种创伤性小、特异度和敏感度均较高的检测方法，在未来无创诊断、提供新的治疗靶点和预后信息等的价值将得到进一步的提高。

选自中华检验医学杂志2019,42(1)