转自：百迈客医学（微信公众号）

研究背景

环状RNA（circRNA）是一类知之甚少的非编码RNA，其中一些已被证明对细胞增殖和发育具有功能重要。CircRNA主要来自编码mRNA的反向剪接事件，使得难以区分circRNA与线性剪接的mRNA的内部外显子组成。为了检查circRNA的全局外显子组成，作者使用纳米孔技术对人和小鼠脑源RNA进行了单分子长读长测序。

研究方法

将总人或小鼠脑组织RNA进行DNA酶处理并去除rRNA，然后用RNase R处理以消化线性RNA。为了进一步富集circRNA，将剩余的线性RNA多聚腺苷酸化（poly A tailing）并使用poly（A）纯化磁珠去除带polyA尾的RNA分子。收集富含circRNA的上清液并将其片段化（温和水解切口）以使circRNA线性化。从3'末端除去磷酸基团并在线性化RNA的5'末端添加磷酸基团后，对获得的RNA库进行多聚腺苷酸化，以与ONT测序方案一致。接下来进行ONT全长转录组建库。

研究结果

1、ONT circRNA测序方法

只有一小部分RNA是环状的（例如，小鼠神经系统中去rRNA的RNA库中仅占约0.1％）。作者采用上述方法进行circRNA-ONT测序，由于有些线性RNA分子对RNase R具有抗性，故而此方法比普通的去线性circRNA建库多了一步：将剩余的线性RNA多聚腺苷酸化（poly A tailing）并使用poly（A）纯化磁珠去除带polyA尾的RNA分子。结果表明，该步骤使circRNA强烈富集。

2、circRNA nanopore测序数据产出

人和小鼠circRNA文库的纳米孔测序分别产生0.67M和1.06M reads，其中3.2％和3.3％跨越circRNA BSJ（Back splice junction）位点。人和小鼠中分别鉴定到7,834和10,975个circRNA，其中1,319个在人和鼠中保守的circRNA。在最高表达和保守的circRNA中，发现众所周知的脑circRNA，例如circRims1、circRims2、circHipk3、circCdyl和circZfp609。整个数据集中，分别来自人和小鼠的2,945和7,052个circRNA先前未在circBase中注释。

两个高丰度circRNA：Hipk3和Zfp609（具有可变3'剪接位点的新型外显子）的外显子分布图分别显示在下图：

3、长读长测序全面绘制circRNA外显子-内含子组成

将所有小鼠和人跨越BSJ reads与各自的参考基因组比对，并定量比对到外显子或内含子区域的碱基对的数量。为了将分析集中于更丰富的circRNA中的内含子保留和其他可变剪接事件，仅进一步研究了具有10个或更多BSJ reads并具有高于3％的平均内含子百分比的circRNA。作者发现3个人和4个小鼠circRNA具有内含子保留，而39和57个circRNA包含分别在人和小鼠的RefSeq中未注释的外显子序列。CAMSAP1 是circRNA内含子保留实例，其仅发生在人RNA中；LPXN circRNA是仅在人中表达的circRNA。

可选择性外显子使用是人和小鼠circRNA中的普遍现象，circRNA的可变剪接模式通常在小鼠和人之间共享。circRNAs中使用的大多数外显子都在RefSeq中注释，但值得注意的是，人和小鼠表达良好的外显子（>5 reads）中1.9％（73个外显子）和2.1％（96个外显子）分别是新的、以前未在RefSeq中注释过。仅观察可变剪接的外显子，人和小鼠中新外显子的百分比分别增加到8.7％（21个外显子）和6.8％（12个外显子）。对于人circPPP6R2和circRBM23以及小鼠circBrsk2和circNrxn1（下图A-D）显示了广泛的可变剪接事件实例，其中circPPP6R2为包含未注释外显子的circRNA的实例。

4、circRNA新外显子使用进一步分析

将circRNA根据新外显子使用分类为“隐蔽的circRNA外显子”（与注释的外显子共享5'或3'剪接位点）或“独特的circRNA外显子”（全新的外显子）。人类2,393个外显子中的91个和小鼠中2,487个外显子中的82个是独特的circRNA外显子，140和163个分别是隐蔽的circRNA外显子。（所有单外显子circRNA都被排除在该分析之外，因为在单个read中需要完全覆盖检测到的外显子，这对于单个外显子circRNA而言在技术上是不可能的。）作者发现大多数独特的circRNA外显子在40-200bp范围内，但也经常观察到3-6bp的非常短的外显子（微外显子）组。有趣的是，大多数circRNA特异性外显子导致移码突变或终止密码子获得，可能解释了它们在线性mRNA翻译中缺失，因此受到无义介导降解。

小结：纳米孔测序技术提供了一种快速可靠的方法来绘制circRNA的特定外显子组成。

参考文献：

Rahimi K, Veno M T, Dupont D M, et al. Nanopore sequencing of full-length circRNAs in human and mouse brains reveals circRNA-specific exon usage and intron retention[J]. BioRxiv, 2019: 567164.