转自： 生信菜鸟团（微信公众号）

circRNA的表达很复杂。一般情况下，circRNA的表达水平很低，但是由于特殊的拓扑结构，能够在某些组织中积累较高的水平；circRNA由可变剪切产生，受到剪切子等调控，能够在同一基因座上产生多个不同组成成分的circRNA，参与调控多个生命过程，是真核转录本重要的成员之一。目前，circRNA的功能主要包括调控转录和剪切水平、通过吸附或着结合miRNA和蛋白发挥功能、编码等功能参与生理病理过程，由于circRNA通常稳定存在在细胞及血液中，因此能够作为新型的生物诊断指标。本篇将概述circRNA的研究方法。

《2018研究前沿》报告中的circRNA

科学研究的世界呈现出蔓延生长、不断演化的景象。科研管理者和政策制定者需要掌握科研的进展和动态，以有限的资源来支持和推进科学进步。对于他们而言，洞察科研动向、尤其是跟踪新兴专业领域将对其工作产生重大的意义。

2018年10月24日，中科院科技战略咨询研究院、中科院文献情报中心与科睿唯安联合发布了《2018研究前沿》报告和《2018研究前沿热度指数》报告。报告主要从每个 ESI 学科前 10% 的最具引文影响力的研究前沿 , 整合出十大领域并根据核心论文出版年的平均值重新排序，遴选出每个领域中100 个热点前沿和38 个新兴前沿。circRNA继去年荣登生物科学TOP10热点榜单后又荣登新兴前沿榜单。

（图片来自于《2018 研究前沿》）完整内容单击阅读原文

circRNA测序项目的概述

一般情况下，circRNA二代测序项目对RNA样本的要求为：RNA总量≥5μg；RNA浓度为100ng/μL，建库过程需使用Ribo zero去除rRNA，RNase R去除线性RNA，链特异性PE150测序。单个样本数据量约8G左右，三次生物学重复。数据下机后，需先对数据进行质控，去接头序列及低质量序列，选择不同的程序有参/无参比对分析，随后对鉴定的circRNA候选者信息分类描述、差异表达分析以及功能预测。

circRNA鉴定程序描述

目前，公开发表的circRNA鉴定程序已超过十余种，按照鉴定原理能够分为两类：一类是针对内含子驱动模式下反向可变剪切接头序列(back-spliced junction)设计的预测软件，代表程序有 find_circ2、CIRI2、CIRCexplorer、MapSplice 等；第二类软件首先通过基因组注释信息推测获得反向可变剪切接头序列，然后再与注释的外显子序列进行匹配，获得新预测的circRNA，如 KNIFE、NCLscan 等。介于动植物circRNA序列特征并不一致，植物特异的鉴定程序 PcircRNA_finder 在植物 circRNA 的鉴定中更具优势。虽然一些程序支持无参组装结果进行独立注释信息，但是完善的基因组注释能够进一步提高剪切接头检测的灵敏度、扩大剪切信号的检测范围，同时降低错误率。综合考量程序计算成本，结合两种或多种不同软件预测的结果将有效提高 circRNA 鉴定的效率。

实验验证

根据验证目的不同实验大致能够分为两大类：一是序列验证，包含PCR扩增以及 NB assays；第二类是功能验证，包括RNAi介导、 CRISPR/Cas9的抑止表达手段和构建载体的过表达。由于大多数circRNA的表达低于其相关线性转录本，因此使用RNase R消化的富集方法可能无法完全破坏线性RNA，应谨慎使用以RNA荧光原位杂交的circRNA成像技术(RNA fluorescence in situ hybridization, FISH)；Tanenbaum等人通过CRISPR / Cas9或Cas13结合增强荧光蛋白标记系统捕获了24个GFP，为活细胞circRNA中的追踪及成像提供了方法。

研究方向

基础的circRNA转录组文章大致分为：5分以下的工作内容为数据筛选后进行序列验证，全基因组下的circRNA功能注释，借助miRNA海绵、circRNP等功能互作实验验证筛选获得的"明星分子"相关的circRNA，文章能够跨一个台阶。而10分以上的文章就需要有新颖实验策略或者找到了新的重要的circRNA并在关键生理、病理过程中发挥了作用，具有潜在的应用价值。当然，circRNA作为一个新兴的研究热点，开发生信分析工具也是发表文章比较好的切入点，包括数据库、鉴定程序等。

主要参考文献

[1] Li, X., Yang, L., & Chen, L. L. (2018). The biogenesis, functions, and challenges of circular RNAs. Molecular cell.

[2] Gao, Y., & Zhao, F. (2018). Computational strategies for exploring circular rnas. Trends in Genetics Tig.