转载：百迈克生物

研究背景：

microRNA（miRNA）通过抑制靶基因的翻译来调节基因表达。之前的工作已经确定了miRNA在调节血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）活性中的作用。环状RNA（circRNA）是否参与VSMC中miRNA活性的调节尚不清楚。

研究目的：

识别与VSMCs富含的miRNA相互作用并调控细胞活性的circRNA。

研究方法和结果：

1、公共数据挖掘：

已发表人VSMCs RNA-seq数据鉴定所有VSMCs生物学重复中共有的稳健表达的circRNA；

2、RNA-seq：

小鼠主动脉的三个生物学重复（RNA提取前去除了内膜和外膜层），鉴定人类和小鼠VSMCs之间保守的circRNA；

3、靶向miRNA分析：

对于之前在VSMC具有重要生物学作用的miRNA，至少包含其中2个miRNA的保守结合位点：只有一个circRNA具有miR-145-5p结合位点，在小鼠和人之间是保守的。（小鼠中已被命名为circ_1529，人类中命名为circ_8932，其来源基因为Lrp6，其至少具有7个miR-145-5p结合位点）

4、验证VSMC中富含circ_Lrp6：

divergent primer扩增cDNA和gDNA，验证其来源于可变剪接；RNAse R抗性检测；放线菌素D处理抑制转录证实circRNA的稳定性（更长的turn-over时间）；qRT-PCR检测各组织中circ_Lrp6表达水平并结合RNA-seq数据进行分析：circ_Lrp6和Lrp6在血管中富集。

5、Circ_Lrp6是miR-145的海绵分子

共定位实验：若二者互作应共定位，原位杂交和核/细胞质分离评估它们在小鼠原代VSMC中的定位，在细胞质中高度富集；

评估circ_Lrp6对miR-145活性影响：构建circ_Lrp6过表达和shRNA载体，双荧光素酶报告基因试验，证实circ_Lrp6对Itgβ8等miR-145各靶基因的作用直接依赖于miR-145与共靶mRNA 3’UTR的结合。

circ_Lrp6与miR-145直接结合：AGO2 IP实验验证二者与AGO2结合（circRNA与miRNA的结合由AGO2介导）；RIP实验验证二者之间直接结合；等。

6、circ_Lrp6在VSMC中的生物学作用

LOF和GOF实验：划痕实验等证实circ_Lrp6沉默降低迁移能力和损害细胞增殖，增加了VSMC分化标志物平滑肌肌动蛋白和转运蛋白。rescue实验进一步证实上述发现；

血小板衍生生长因子（PDGF-BB）和转化生长因子（TGF-β）分别处理VSMC，在TGF-β处理的细胞中circ_Lrp6和miR-145表达之间存在负相关。

验证circ_Lrp6和miR-145表达是否随病理改变：缺氧有助于血管疾病的发病机理，缺氧与强烈下调的miR-145相关。

7、Circ_Lrp6与血管疾病

不同病理状况circ_Lrp6和miR-145表达分析：例如动脉粥样硬化血管患者中，miR-145的表达显著降低，但circ_Lrp6没有显著变化，在复杂的病理学中两个ncRNA在基因表达方面解离。

评估circ_Lrp6调节是否可能影响小鼠血管损伤模型中的病理反应，检测了在ApoE-/-小鼠颈动脉狭窄模型中特异性敲低circ_Lrp6的抗增殖作用。

综上，两种ncRNA在小鼠和人类疾病的血管病变中受到不同的调节，并且circ_Lrp6的调节可能影响血管疾病的发展。

参考文献

Hall I F, Climent-Salarich M, Quintavalle M, et al. Circ_Lrp6, a Circular RNA Enriched in Vascular Smooth Muscle Cells, Acts as a Sponge Regulating miRNA-145 Function[J]. Circulation Research, 2018.