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作者: Protein&PTM |精准医学与蛋白组学

 

非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)因不能编码蛋白质而被称为基因组中的“暗物质”或“垃圾RNA”。近些年的研究证明,非编码RNA在许多生命活动过程中扮演着重要角色,大多与疾病息息相关,在癌症生物学中起到重要的作用,提供潜在的癌症治疗靶点,该领域的研究也是近期最热的生物学课题之一。

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随着蛋白质组学和生物信息学的发展,越来越多的非编码RNA 的调控机制被揭示,其中常见的具调控作用的非编码RNA包括miRNA、circRNA以及长链非编码RNA。今天综合这几个经典研究案例,介绍一个相对比较完整的非编码RNA蛋白组研究思路。

 

miRNA与蛋白质组学

 

西北农林科技大学的童德文教授课题组在Molecular&Cellular Proteomics上发表论文。研究者结合TMT蛋白质组学技术对miRNA展开研究,发现猪传染性胃肠炎病毒侵染时,miR-4331通过靶向RB1,上调IL1RAP并激活p38 MAPK通路促进线粒体损伤。

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技术路线

 

研究者利用miR-4331 mimics转染PK15细胞(相当于Over expression),并以Lipofectamine 3000作为阴性对照;用TGEV侵染mimics细胞和control细胞24h,未侵染为对照;收集细胞进行TMT定量蛋白质组学分析,找到miRNA调控的蛋白质;验证与功能实验。蛋白质组学技术路线如下:

 

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图1 miRNA与蛋白质组学研究技术路线

 

实验结果

 

1、 鉴定了4209个蛋白质,其中4165个蛋白质可以定量;

2、 69个差异蛋白质(1.2倍),其中上调33个,下调36个;

3、 LC-MS/MS、RT-PCR、western blot结果表明线粒体蛋白质IL1RAP和RELA的丰度随miR-4331过表达增高。

 

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图2 miRNA引起蛋白质组改变

 

lncRNA与蛋白质组学
来自中科院水生生物研究所葛峰老师结合SILAC蛋白质组学与lncRNA研究发现:lncRNA HOTAIR通过调控阿片生长因子受体OGFr促进肝癌细胞增殖,研究结果发表在蛋白质组学Top期刊Molecular&Cellular Proteomics上。

 

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技术路线

 

通过转染siRNA沉默HepG2细胞中的HOTAIR,同时转染空载体为阴性对照;对转染siHOTAIR和siNC的HepG2细胞分别进行iTRAQ蛋白质组学和转录组学分析;生物信息学分析寻找HOTAIR的靶点。

 

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图3 lncRNA与蛋白质组学研究技术路线

 

实验结果

 

1、转录组发现673个DEGs,268个上调基因,405个下调基因;

2、蛋白组定量了6547个蛋白质,鉴定了293个DEPs,147个上调蛋白质,146个下调蛋白质;

3、分析蛋白组与转录组关联性,86个蛋白质(基因)在蛋白组和转录组水平变化趋势一致;

4、初步确定21个与HOTAIR抑制相关的DEPs,并利用靶向蛋白质组学技术PRM验证了这21个蛋白质的丰度,发现PRM数据与iTRAQ数据一致。

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图4 组学数据生物信息学分析

 

cicrRNA与蛋白质组学

 

葛峰老师发表在Journal of Proteome上的另一篇文章可作为circRNA与蛋白质组学研究的经典案例,葛老师利用定量蛋白质组学策略对HCC细胞中CDR1as调控蛋白进行分析。作者在HepG2细胞中发现了330个不同表达的蛋白(DEPs),表明它们可能是CDR1as调控的蛋白。生物信息学分析表明,许多差异蛋白参与了细胞增殖和细胞周期。

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技术路线

 

在HepG2中进行了转染实验,将CDR1as在细胞内进行过表达,与空载组(EV)进行定量蛋白质组学分析;生物信息学分析找到差异蛋白质,进行聚类和GO分析;WB验证组学数据。

 

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图5 circRNA与蛋白质组学研究技术路线

 

实验结果

 

1、 在HepG2细胞中发现了330个不同表达的蛋白(DEPs),表明它们可能是CDR1as调控的蛋白;

2、 生物信息学分析表明,许多差异蛋白参与了细胞增殖和细胞周期;

3、 进一步对表皮生长因子受体(EGFR)的功能研究发现,CDR1as至少部分通过调节EGFR表达对细胞增殖有影响。

 

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图6 差异蛋白质生物信息学分析

 

参照以上三个典型案例,我们可以总结出运用蛋白质组学手段研究非编码RNA(包括miRNA、LncRNA、CircRNA)的经典研究思路。

 

1、首先在细胞水平或动物水平实现非编码RNA的过表达或抑制或沉默;

2、结合蛋白质组学、修饰蛋白质组学或转录组学等高通量组学手段筛选受目标RNA调控的差异分子,绘制调控网络;

3、运用靶向蛋白质组学PRM技术等验证蛋白质组学数据,qRT-PCR验证转录组数据。

 

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图7 非编码RNA蛋白质组学研究思路总结

 

参考文献:

Zhao, X., et al. (2017). Microrna-4331 promotes tgev-induced mitochondrial damage via targeting rb1, up-regulating il1rap, and activating p38 mapk pathway in vitro. Molecular & Cellular Proteomics Mcp, mcp.RA117.000432.

Wu, Y., et al. (2017). Integrated proteomic and transcriptomic analysis revealslong noncoding rna hotair promotes hepatocellular carcinoma cell proliferation by regulating opioid growth factor receptor (ogfr). Molecular & Cellular Proteomics, 17(1), 146.

Yang, X., et al. (2017). Quantitative proteomics reveals the regulatory networks of circular rna cdr1as in hepatocellular carcinoma cells. Journal of Proteome Research.

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