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前言:环状RNA (circRNA)是一种新兴、广泛存在、丰富且进化保守的非编码RNA。它们在细胞发育、生长和肿瘤形成过程中发挥着重要而多样的作用。为了研究circRNA功能,需要对其表达进行调控。

 

虽然某些circRNA在细胞中高表达,但大多数还是低表达的。因此,过表达circRNA是研究其功能的有力方法。

 

首先,互补序列介导的RNA环化是circRNA过表达的经典策略。其次,将Quaking的RNA结合基序插入侧接所需外显子的内含子有助于circRNA的生物发生。另外,还使用过基于tRNA的剪接机制来过表达circRNA。然而,这些方法存在一些缺点,例如表达效率低,构造载体复杂且耗时长,需要在目的细胞中表达RNA结合蛋白,以及不准确的circRNA剪接等,这些都限制了它们在circRNA功能研究中的应用。因此,仍然需要一种方便,高效,准确的circRNA表达系统。

 

为了实现这一目标,我们提出了经典的互补序列介导的高拷贝数circRNA表达的circRNA环化的修订版。circRNA表达盒由三部分组成:两个反向互补序列(每个约800bp)由特定基因的上游内含子组成,环形RNA形成外显子,其两侧是特定的上游和 下游内含子序列(每个约200bp)保留剪接识别和聚嘧啶束(PPT)。插入circRNA外显子下游的上游内含子在转录后产生稳定的RNA发夹结构,促进外显子剪接成环状RNA。通过将所需的circRNA序列插入到互补内含子序列之间的多克隆位点(MCS)中,该载体可以用作表达各种circRNA的通用载体(图1)。

 

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载体图谱,该载体骨架是pcDNA3.1

 

以此载体构建的circRNA表达水平比内源性水平高400-5000倍,转化效率高于55%,副产物降至最低。

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表达效果验证

 

高效表达circRNA载体protocol部分截图

 

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文章:bioworld 微信公众号

circRNA-moban

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