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就像老是后悔20年甚至10年前没有买房一样,很多人在lncRNA火了之后立马着眼于circRNA了,害怕错失良机。
今天来看一篇8分的circRNA研究吧。

 

来自于台湾国立成功大学医学院特聘教授蔡少正课题组,主要从事以下研究:

 

一、缺氧诱导因子(HIF-1α)调控基因与癌症抗药性之研究。细胞因为缺氧会产生种种不同的生理反应或病理变化,包括学习记忆、癌症、心血管疾病、生长迟缓、脑部疾病、肺部疾病等。我们利用生物信息学的方法,将基因体中会受缺氧诱导因子调控之基因(包括人类、大鼠、小鼠)找寻出来,并研究其在生理、病理上的功能,尤其着重在癌症抗药性方面的探讨,目前以大肠癌及胰脏癌的抗药性机制为重点;

 

二、研究整个基因体的调控及细胞分化、去分化及再分化的机制。表观基因体调控对细胞之命运影响至巨,甚或造成细胞病变。利用生物信息学、功能性基因体学、系统生物学等尖端方法,对此一现象作深入的研究;

 

三、探讨子宫内膜异位成因之分子机制。本实验室过去十几年的研究,在这个领域已有相当杰出的成果,居于世界领先地位,未来将着重在整合性基因功能上的研究,期盼能发展出可以治疗该疾病的方法或药物。

 

Non-coding effects of circular RNA CCDC66 promote colon cancer growth and metastasis. Cancer Res. 2017 Mar 1.

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本文的第一作者是该课题组博士后萧贵阳。CircRNA CCDC66是一条非常新的circRNA,由CCDC66基因编码。课题组发现在息肉及结直肠癌中circCCDC66的表达是调控的,并且与预后状况呈负相关。体外实验表明,circCCDC66调控多个病理过程,包括细胞增殖、迁移、侵袭、锚定非依赖性生长。深入研究表明,circCCDC66通过调控多个肿瘤基因来实现上述功能。体内实验表明,敲减circCCDC66后能抑制肿瘤的增殖、侵袭作用。这表明,circCCDC66在肿瘤进程及转移过程起着重要的作用。

 

主要内容:

 

1、筛分子

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课题组建了一套方法,以增加map率。

 

接着作者筛选了一些亲本基因参与调控细胞周期、信号传导、表观调控、转录调控的circRNAs作为后续研究。而其中CCDC66基因的转录生物学功能鲜有报道,所以课题组决定选择circCCDC66做进一步的研究。

 

2、验证

 

通过结直肠癌细胞株、乳腺癌细胞株、胰腺癌细胞株、宫颈癌细胞株实验发现,circCCDC66在肿瘤细胞中的表达上调了,这表明在肿瘤发生时circCCDC66表达普遍提升。另外,研究发现线性CCDC66在肿瘤中的表达要低于其对应的癌旁组织。

 

且证实了缺氧条件能降低线性CCDC66转录本的水平,而circCCDC66表达无显著变化。这说明瘤内的缺氧应激能促进circCCDC66积累循环,并且由于自身的稳定性能加强这种积累作用。

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3、临床相关

 

首先,发现circCCDC66在癌前息肉组织中表达提升了,且在肿瘤组织中的水平更高。且在不同分期内,其在肿瘤中的水平都是高于癌旁组织。结合生存曲线,发现circCCDC66与不良预后相关。

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且通过ROC曲线计算出AUC为0.88,这表明circCCDC66是CRC病人病情检测和预后的一个非常好的marker。

 

4、功能验证

 

研究组设计了特定的反向剪接点的siRNA,特异性敲减circCCDC66(对线性的CCDC66 mRNA无影响)后,肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显降低。

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过表达circCCDC66能增加细胞的克隆形成,BrdU核素掺入法表明circCCDC66能刺激DNA合成。

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circRNA和mRNA及lncRNA类似,均有吸附miRNA的功能。作者通过预测,发现有99个miRNAs与circCCDC66有结合位点,这暗示着在结直肠癌中circCCDC66可能保护着一些癌基因免受miRNAs的干扰。同时结合GEO数据库中3组数据显示,这99个miRNAs中有66个在结直肠癌中表达。

 

作者通过分析结直肠癌中有显著差异表达的癌基因及肿瘤抑制基因,结果发现有37.5%的肿瘤基因与circCCDC66相关miRNAs存在结合位点,而仅有23.5%的肿瘤抑制基因与circCCDC66相关miRNAs存在结合位点。

 

进一步实验表明,DNMT3B、EZH2、MYC、YAP1这些与预测miRNAs存在结合位点的蛋白,在circCCDC66过表达时其丰度显著上调了。而其中EFNA4、FGF9这两个与预测miRNAs无结合位点的分子,则不受circCCDC66表达变化的影响。

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接着验证circCCDC66的miRNA sponge作用。将带有生物素的线性RNA环化,用环化后的RNA去pulldown miRNAs。结果显示,miR-33b、miR-93、miR-185三条被预测与circCCDC66存在结合作用的miRNAs被带有生物素的circCCDC66富集下来。另外,实验表明在过表达circCCDC66时,MYC(circCCDC66上调蛋白)其3′-UTR区活性增强(miRNAs吸附减少)。敲减circCCDC66后发现MYC mRNA表达显著减低。Rescue实验(加入miR-33b、miR-93抑制剂)后则能回复MYC mRNA水平。这些结果均表明circCCDC66能作为miRNA的海绵,调控MYC表达。

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5、体内实验

 

体内实验表明,circCCDC66敲减后肿瘤在体内的生长水平受到了抑制。

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文章:小张聊科研

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