环状RNA结合蛋白形成复合物

8月11日，国际知名杂志Scientific Reports 发表了环状RNA功能的重要文章，通讯作者为德国吉尔大学的Albrecht Bindereif教授。本文基于甘油密度梯度离心法分析鉴定到与蛋白相互作用的环状RNA(Schneider et al., 2016)。本文的技术方法和结论对于环状RNA的研究有重要借鉴意义。

环状RNA与蛋白形成复合物的线索

作者本项工作的思路由从个别环状RNA在胞质裂解液中密度梯度分布入手，首先验证了12种已知的高丰度的环状RNA分子的分布情况，利用跨越环化位点的引物进行半定量PCR检测。用抽提的胞质总RNA作为对照，可以知晓游离的目标RNA分子在密度梯度离心实验中出现的位置。作者还进行了蛋白酶K消化的实验进行对照。实验结果表明，所挑选的12种环状RNA分子在胞质裂解组分中相对于游离RNA存在迁移率改变，均表现为沉降系数增大，意味着有其他稳定结合的分子。蛋白酶K消化后密度梯度离心后出现目标分子的位置回归到游离RNA的状态。

图1 沉降分析环状RNA分布情况。（来自(Schneider et al., 2016)）

A. 挑选12种已知的Hela中高表达的环状RNA，设计引物PCR分析其在甘油密度梯度离心实验中不同沉降系数区域的分布。RNA组为提取后的胞质RNA对照，可现实游离目标环状RNA的沉降系数分布情况，extract组为胞质裂解液S100组。结果显示胞质分离组分中目标环状RNA分子均出现沉降系数增大的情况。

B. 目标环状RNA分布拟合曲线。与A图对应，虚线为蛋白酶K消化对照，从分布图中很明显看出这12种环状RNA在沉降分析的实验中均出现比游离RNA分子沉降系数变大的情况，而蛋白酶K消化后这一差别消失。初步得到目标环状RNA与蛋白形成复合物的线索证据。

沉降分析法没有发现所挑选的环状RNA存在翻译活动

作者首先怀疑是不是环状RNA因为存在蛋白翻译活动，结合了核糖体才导致沉降系数变化的？作者用到了两种工具药物：放线菌酮（cycloheximide，CHX）和嘌呤霉素（puromycin，Puro）。放线菌酮能稳定RNA和核糖体的结合，嘌呤霉素促进RNA与核糖体解聚。用这两个工具药物，选取线性HIPK3 的mRNA分子作为对照，分别用防线菌酮和嘌呤霉素处理，HIPK3 的mRNA分子对照组的沉降系数出现明显的改变，然而作者选取了上述12种环状RNA分子中的10种验证后均没有发现沉降系数有变化。因此作者得出结论，没有发现所挑选的环状RNA存在翻译活动。

图2 沉降分析表明所筛选的环状RNA分子没有出现蛋白翻译活动。（来自(Schneider et al., 2016)）。CHX：放线菌酮，可以未定RNA与核糖体的结合作用。Puro：嘌呤霉素，促进RNA与核糖体的解聚。

鉴定IMP3相互作用的环状RNA分子

作者首先采用了常规的单核苷酸交联免疫沉淀分析（iCLIP），挑选了IMP3作为研究对象，在人类肝癌细胞株HepG2中相关分析。IMP3蛋白是一种多功能的RNA结合蛋白，也是一种重要的肿瘤标志物分子。作者基于iCLIP分析，将所有拉下来的RNA直接进行建库分析。结果不理想，没有得到有效的环状RNA环化位点的Reads。于是作者调整技术体系，不再用交联的条件，而改为直接用抗IMP3的抗体进行免疫沉淀，产物提取总RNA进行二代测序分析。

图3 IMP3相互作用环状RNA鉴定技术路线。（来自(Schneider et al., 2016)）

作者同时扩大了检测样本的体量，增加了两株IMP3阳性的胰腺癌细胞株PANC1和PATU细胞。最终鉴定到了12种与IMP3存在相互作用的环状RNA分子。

图4 基于免疫沉淀和RNA-Seq分析鉴定到12种IMP3相互作用的环状RNA分子。（来自(Schneider et al., 2016)）

为了排除这些特征性环状RNA分子是否受到来自所对应的线性RNA的干扰，作者也进行了RNase R消化的对比分析，结果表明，基于上述技术路线所获得的候选分子的确为环状RNA。

图5 候选RNA分子RNase R消化鉴定。（来自(Schneider et al., 2016)）

IMP3结合的环状RNA的验证

作者继续利用抗IMP3抗体进行免疫沉淀分析，所获得的RNA直接进行反转录和PCR鉴定。挑选了12种分析得到的候选环状RNA分子中的三个进行了反转录PCR验证，结果表明在IMP3相互作用的RNA分子中的确有这些环状RNA的存在。作者也进行了QPCR的验证结果与此一致。

图6 IMP3相互作用的环状RNA分子反转录验证。（来自(Schneider et al., 2016)）

A. 半定量反转录PCR验证三个候选环状RNA。B. QPCR验证实验。

作者接下来再次利用沉降分析验证所筛选到的环状RNA。与文章开始时所得出的结果非常相似。但IMP3蛋白的Western实验表明有些IMP3分子肯跟并不结合所指定的环状RNA分子。

图7 沉降分析验证IMP3相互作用环状RNA分子。（来自(Schneider et al., 2016)）

IMP3结合环状RNA的序列元件分析

通过上述分析鉴定初步得到了一些与IMP3相互作用的环状RNA分子，它们之间是如何结合的？有没有特定的motif序列元件？于是作者设计了体外实验进行筛选鉴定。体外表达了GST-IMP3，利用GST标签快速纯化目标蛋白，GST单体标签作为对照，在体外通过结合20个碱基的RNA随机序列样品池，与GST-IMP3结合的RNA分子用二代测序分析鉴定，以GST为对照，比对分析后获得了IMP3结合环状RNA的motif序列元件，结果表明IMP3更倾向于结合富含C/A的序列。作者进一步分析了之前所鉴定到的IMP3结合的环状RNA分子中是否具备这类功能元件，结果表明确实有富含C/A的序列存在。

图8 体外分析IMP3结合环状RNA的motif元件分析技术路线。（来自(Schneider et al., 2016)）

总体而言，本文为环状RNA研究技术和思路提供了全新的借鉴。诸位同仁可以考虑从环状RNA结合蛋白的筛选验证等角度入手找出与所感兴趣的环状RNA有密切关系的蛋白组分，不失为环状RNA功能研究的重要思路。

但文中还是有些不太完善的地方，比如作者一开始选择了12种已知的含量相对较高的环状RNA进行沉降系数分析，结果一致性还是挺高的。但到了验证是否存在翻译活动的时候，变成了验证其中的10个，没有验证GLIS3和CDYL2。是否这两个环状RNA在所设计的实验体系中出现了不好解释的奇怪现象，作者有意做了回避？我们不得而知，但作者仅依据相对不太严谨的实验体系否定环状RNA翻译蛋白活动时不严谨的结论。还需要直接分析核糖体与这些环状RNA分子的直接相互作用是否存在等。

本文研究环状RNA的技术体系和思路均有别于传统，还是有不少值得学习的技术方法的。基于细胞裂解液的沉降分析是生化分析的重要技术，将其应用于环状RNA的研究非常值得借鉴。从本文一开始的数据来看，环状RNA似乎很少以游离方式存在，当然也不排除作者专门挑选了阳性结果列举出来的可能性。对于我们自己的研究课题而言，完全值得考虑所感兴趣的环状RNA分子是否存在结合蛋白或其他类型的生物分子的可能性。

参考文献：
Schneider, T., Hung, L.H., Schreiner, S., Starke, S., Eckhof, H., Rossbach, O., Reich, S., Medenbach, J., and Bindereif, A. (2016). CircRNA-protein complexes: IMP3 protein component defines subfamily of circRNPs. Sci Rep 6, 31313.