circRNA社区-小技能2条评论

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2017年国自然申请标书递交的日子步步逼近,想必大家都在努力完善自己的标书吧。近年来,随着国自然基金在职业晋升中参考比重越来越大,申请热度也越来越来高,选择性资助也越来越看重个人的工作背景,其中拥有一篇的五分文章成了国自然面上的默认标配。

 

今天就通过一篇5分的circRNA文章,简单介绍这类文章的研究思路,并引出一篇青年项目研究内容的设计。

 

Circular RNA ZNF609 functions as a competitive endogenous RNA to regulate AKT3 expression by sponging miR-150-5p in Hirschsprung’s disease.(Oncotarget, 2017, Vol. 8, (No. 1), pp: 808-818)

 

这是Oncotarget于2016年11月份接收的一篇文章。今天我们不讨论Oncotarget的Reputation,所以对于拥有多篇Cancer Research这种level及以上文章的专家完全可以不用care梦熊的胡诌。

 

该文的通讯作者是南京医科大学儿童医院唐维兵主任医师。唐主任主要做新生儿的消化道畸形诊治。该研究团队报道了一条在先天性巨肠症中的circRNA-ZNF609,在正常的肠道组织中该环状RNA的表达量要高于患病组织中的丰度。细胞实验发现,下调ZNF609能抑制增殖与迁移。接着通过预测的发现了一些可能与ZNF609结合的miRNAs,其中有一些miRNAs的靶基因是AKT3,最后,通过RIP、荧光素酶报告基因实验证实ZNF609能Sponge miR-150-5p,调控AKT3的表达。

 

关于环状RNA,我们之前也简单聊过:(文章篇)S5E49:看看国内团队是怎么研究环状RNA的?
接下来,就通过这篇文章阐述一下写国自然青年基金时的一些思路:

 

1、确定分子

circrna1

 

circRNA-ZNF609(hsa-circ-0000615)定位于第15号染色体,全长874个碱基。前期已经报道了,在神经元细胞中,circRNA-ZNF609(hsa-circ-0000615)是高表达的,在中枢神经发育过程中起到很重要的作用。在该报道中,作者认为该分子应该在肠道神经系统发育过程中起到重要的作用。

 

2、确定表型

 

circRNA-ZNF609是一条新的环状RNA。那么作者通过预实验发现,在80例先天性巨肠症组织中的表达要低于正常肠道组织中的表达量。这就或许表明circRNA-ZNF609参与了先天性巨肠症的致病过程。

 

既然circRNA-ZNF609可能参与了致病过程,那么通过细胞实验来确定,circRNA-ZNF609到底能引发细胞的哪些表型变化。

 

circrna3

 

干扰掉circRNA-ZNF609能抑制细胞的增殖与迁移,过表达后则能促进细胞的增殖与迁移。

 

3、确定功能

 

先确定该分子的定位,实验证实circRNA-ZNF609主要定位于胞浆,这表明该分子主要参与了转录后调控。

circrna4

 

前期已经报道,大多数环状RNA属于内源性非编码RNA,其物种之间有较高的保守性,相对于线性的RNA,circRNA具有很高的稳定性。circRNAs报道有大量的miRNAs结合位点,可以像lncRNA那样作为miRNAs Sponge吸附miRNAs,调控下游靶基因的表达。
其中有一个功能是ceRNA预测。通过预测,作者发现其中有一条miR-150-5p评分最高(评分越高,越可能结合)。并且验证了它们之间通过这段序列配对结合。

 

circrna2

 

预实验验证,在先天性巨肠症组织中miR-150-5p是高表达的。

 

circrna5

 

4、寻找靶基因

 

有了ceRNA机制,理所当然的是找靶基因了。依然是预测,作者通过DIANA、miRanda、PicTar、PITA四个数据库预测,取交集得到了3个基因:AKT3、FOXO4、ELK1。预实验发现,在先天性巨肠症组织中AKT3的mRNA显著降低,而FOXO4、ELK1的mRNA则无明显变化。到这里,我们就可以推测出circRNA-ZNF609通过吸附miR-150-5p,从而上调AKT3的表达。

 

作者通过双变量相关分析,表明AKT3与circRNA-ZNF609的表达呈正相关,和miR-150-5p的表达呈负相关。通过Rescue实验发现,沉默掉circRNA-ZNF609后,能显著降低细胞中的AKT3的mRNA及蛋白的水平;另外加入miR-150-5p的拮抗剂后,能回复AKT3的mRNA、蛋白的水平。

 

circrna6

 

最后,原本我们应该做一下AKT3对细胞增殖和迁徙的作用,但是这里作者没有做,只是做了miR-150-5p对细胞相关功能的影响。

 

最后,重点来了:我们从别人的报道中发现了一个非编码RNA(环状或长链非编码RNA)A,在其他一些组织里有报道,那么这个分子有可能在我们的研究中也可能起到作用。那么我们通过预实验在我们所研究的疾病组织检测,发现A的表达相对于正常组织中是高或低表达的;通过细胞实验发现,干扰或过表达A后,细胞具有某种表型变化。而数据库或预实验发现,该分子是主要定位于胞浆中的,那么我们推测A分子可能通过转录后调控机制参与疾病的发生发展。而circRNA、lncRNA均具有sponge miRNAs的功能,通过数据库预测,发现A能吸附一些特定的miRNAs,选择一个打分比较高的miRNA。接着结合数据库继续预测一些能够与该miRNA结合的mRNA。最后,通过预实验验证在疾病中,该mRNA翻译的蛋白表达情况是否跟A分子呈正相关。那么作为ceRNA调控方式的整体框架就有了A-miRNA-mRNA-疾病发生。

 

来源:小张聊科研

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