原创： 纪照辉 上海生命基因

Circular RNA mediates cardiomyocyte death via miRNA-dependent upregulation of MTP18 expression

circRNA通过依赖于miRNA上调的MTP18表达介导心肌细胞死亡

期刊：cell death and differentiation；影响因子：8.00

发表单位：青岛大学医学院转化医学研究所

导 读

circRNA MFACR作为miR-652-3p的海绵，调节MTP18的表达来介导心肌死亡。

摘 要

在这里，我们显示circRNA MFACR通过直接靶向和下调miR-652-3p调节心脏中的线粒体裂变和细胞凋亡；这反过来通过抑制MTP18翻译来阻断线粒体分裂、心肌细胞死亡和心肌梗死（MI）。我们的研究结果揭示了MFACR/miR-652-3p/MTP18轴作为心脏细胞凋亡的调节剂将是治疗心血管疾病的潜在治疗靶标。

研究背景

据报道，CircRNA在神经系统疾病和癌症中具有重要作用，包括结肠直肠癌和胰腺导管腺癌。因此，circRNA可以作为疾病的新诊断和治疗策略。在正常组织中和在肿瘤样品中的环状RNA同种型的比例之间也存在差异，这表明circRNA可以用作人类疾病的诊断或预测生物标志物。然而，circRNA在心肌细胞中的功能仍然未知。我们的研究首次揭示了circRNA可调节线粒体动力学，心肌细胞凋亡和MI。

结 果

1 MTP18调节心肌细胞中的线粒体分裂和凋亡

将培养的原代心肌细胞进行缺氧/再氧合（A/R），在A/R条件下，心肌细胞中MTP18的水平显著升高，伴随着线粒体分裂和细胞凋亡的显著增加。接下来，我们使用MTP18 siRNA来检测MTP18在A/R诱导的心肌细胞死亡中的影响，MTP18的抑制显著减少了具有片段化线粒体的细胞数量，MTP18的敲低减弱了A/R诱导的细胞凋亡，其显示通过胱天蛋白酶-3活性的显著降低和末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）阳性细胞的数量减少。接下来，我们使用MI的小鼠I/R损伤模型验证了以上结果。这些结果表明MTP18在氧剥夺应激期间参与线粒体裂变介导的心肌细胞凋亡细胞死亡。

2 miR-652-3p调节MTP18表达

首先筛选了培养的心肌细胞中一些已知miRNA的表达水平，在A/R下心肌细胞中miR-652-3p水平显著下调，其他miRNA的水平保持不变。使用RNAhybrid程序的生物信息学分析发现MTP18的3'-UTR具有miR-652-3p的潜在结合位点，有趣的是，miR-652-3p的表达不影响MTP18 mRNA的水平。相反，使用antagomir抑制miR-652-3p增加了MTP18蛋白的水平。此外，miR-652-3p的强制表达减弱了A/R诱导的心肌细胞中MTP18蛋白水平的增加。然后使用荧光素酶测定系统，研究表明miR-652-3p靶向MTP18的3'-UTR以阻止其翻译，MTP18是miR-652-3p的下游靶标。

3 miR-652-3p抑制线粒体裂变和细胞凋亡

在培养的心肌细胞中，miR-652-3p的强制表达减弱了A/R诱导的线粒体分裂和细胞凋亡。这些数据表明miR-652-3p充当负调节因子并抑制心肌细胞中的线粒体分裂和凋亡。类似地，具有I/R（缺血/再灌注）损伤的小鼠的心脏组织中，通过递送miR-652-3p模拟物增强miR-652-3p水平显著降低了I/R损伤的心脏组织中的MTP18表达，其伴随着片段化线粒体和凋亡细胞的减少。随后使用了靶保护技术发现，miR-652-3p在MTP18靶保护剂存在下不抑制线粒体裂变和细胞凋亡，这表明miR-652-3p直接与MTP18相互作用。总之，这些结果证实miR-652-3p直接靶向MTP18以抑制线粒体裂变和细胞凋亡。

4 CircRNA调节体内miR-652-3p的表达

为了确定负责A/R诱导的miR-652-3p抑制上调的circRNA，我们从circRNA在线数据库中随机筛选了circRNAs。然后，我们使用引物评估其表达，qRT-PCR结果显示mm9-circ-016597的显著增加，我们将其命名为MFACR。使用RNAhybrid生物信息学程序分析发现MFACR在miR-652-3p上含有15个结合位点。使用生物素偶联的miR-652-3p模拟物（Bio-652-3p-wt）及其突变体（Bio-652-3p-mut）进行RNA pull-down测定证实MFACR与miR-652-3p的相互作用。接下来，我们使用生物素标记的MFACR探针进行反向下拉测定，并评估miR-652-3p的水平。miR-652-3p的northern印迹分析清楚地检测到MFACR与miR-652-3p的结合，这些数据表明MFACR可以在体内直接结合miR-652-3p。

5 MFACR充当miR-652-3p海绵以调节MTP18表达

用基于载体的系统过表达MFACR，MFACR-ir用作阴性对照。通过RNA印迹和qRT-PCR分析构建体的效率。然后我们分析了MFACR是否调节MTP18的表达和活性。使用具有MFACR构建体的腺病毒过表达MFACR增强了心肌细胞中的MTP18水平，而用siRNA敲除MFACR显著抑制MFACR表达。此外，MFACR拮抗miR-652-3p对MTP18表达水平和活性的抑制。上述结果表明MFACR作为miR-652-3p海绵起作用，调节MTP18在心肌细胞中的表达和活性。

6 MFACR通过miR-652-3p和MTP18调节线粒体动力学和细胞凋亡

在培养的心肌细胞中，MFACR表达的沉默减弱了由A/R诱导的线粒体断裂和凋亡。在小鼠中，MFACR的敲低促进miR-652-3p表达并且在I/R损伤中降低心脏中的MTP18蛋白，减弱了I/R诱导的线粒体分裂的上调，细胞凋亡和MI大小。这些数据表明MFACR有助于促进参与线粒体裂变和心肌细胞凋亡细胞死亡的信号传导。用miR-652-3p和/或MFACR的拮抗剂共转染心肌细胞证实了MTP18是MFACR/miR-652-3p/MTP18信号轴的下游。

讨 论

本研究证实了MTP18的调节机制及其在缺血性心脏病中的致病作用。我们的研究首次发现circRNA MFACR，miR-652-3p和MTP18共同构成调节心肌细胞线粒体裂变和细胞凋亡的信号通路。这为了解线粒体裂变相关的分子事件提供了新的线索，揭示了由心肌细胞异常线粒体分裂引发的凋亡细胞死亡的复杂分子机制。